PDF《DGLC-28》

DGLC-28 二维液相色谱纯化和分析单克隆抗体 关键词:单克隆抗体;

纯化;

分析;

二维液相 DGLC-28 Development of an Automated Method for Monoclonal Antibody Purification and Analysis by 2D-HPLC Key words:Monoclonal Antibody, Puri?cation, Analysis, 2D-HPLC 引言 在生物制药的每个生产环节,产品的纯化和分析过程至关重要.

早期抗体的质量控制过程中,需要测定 样品的效价、聚集体和电荷亚型.单克隆药物(MAb)产品中两个主要的杂质是电荷亚型单抗和单抗聚集体, 这些副产物会产生与主产品不同的药效,有时会引起严重的副作用,如抗药性抗体的形成.蛋白聚体是在生 产过程、纯化或者运输过程中产生(如温度,pH 的影响). 图1(A) UltiMate ?

3000 钛系统 (B) WPS-3000T(B)FC 生物兼容的自动进样器和收集模块 . 在抗体的纯化过程中,第一步用蛋白亲和色谱进行分离.在Protein A 或G色谱柱上进行亲和色谱一步 分离后纯度能到达 95% 以上. 为了确定纯化的效率、 样品的纯度和抗体的质量, 需要采用离子交换色谱 (IEC) 或者体积排阻色谱(SEC)进行测定.SEC 技术用来确定抗体的聚体和体积异构体.离子交换色谱的固定相 能够对蛋白类生物药物的不同电荷亚型进行分离, 通过优化色谱条件可以将这些具有细微变化的亚型分离开. 本文讨论了采用一套 HPLC 系统(如图 1A)实现单克隆抗体的自动纯化和分离(IEC 或SEC).二维 液相色谱可实现复杂蛋白的全自动分析.HPLC 系统的自动进样器具有进样、收集样品和再进样的功能.整 个过程可通过赛默飞变色龙软件实现全自动运行.

216 DGLC-28 二维液相色谱纯化和分析单克隆抗体 关键词:单克隆抗体;

纯化;

分析;

二维液相 DGLC-28 Development of an Automated Method for Monoclonal Antibody Purification and Analysis by 2D-HPLC Key words:Monoclonal Antibody, Purification, Analysis, 2D-HPLC 引言 在生物制药的每个生产环节, 产品的纯化和分析过程至关重要. 早期抗体的质量控制过 程中,需要测定样品的效价、聚集体和电荷亚型.单克隆药物(MAb)产品中两个主要的 杂质是电荷亚型单抗和单抗聚集体, 这些副产物会产生与主产品不同的药效, 有时会引起严 重的副作用,如抗药性抗体的形成.蛋白聚体是在生产过程、纯化或者运输过程中产生(如 温度,pH 的影响) . 图1(A) Thermo Scientific Dionex UltiMate?3000 钛系统 (B) Thermo Scientific Dionex WPS-3000T(B)FC 生物兼容的自动进样器和收集模块. 在抗体的纯化过程中,第一步用蛋白亲和色谱进行分离.在Protein A 或G色谱柱上进 行亲和色谱一步分离后纯度能到达 95%以上.为了确定纯化的效率、样品的纯度和抗体的 质量,需要采用离子交换色谱(IEC)或者体积排阻色谱(SEC)进行测定.SEC 技术用来 确定抗体的聚体和体积异构体. 离子交换色谱的固定相能够对蛋白类生物药物的不同电荷亚 型进行分离,通过优化色谱条件可以将这些具有细微变化的亚型分离开. 图2自动离线 2D 系统结构图(带收集功能的 WPS-3000T(B)FC 自动进样器) 测试条件 HPLC 实验配置 Dionex Ultimate

3000 钛系统: SRD-3600 真空脱气机 DGP-3600BM*2 双梯度泵系统 TCC-3000SD 柱温箱,带生物兼容的切换阀 WPS-3000T(B)FC 分析型,双阀自动进样器 VWD-3400RS 紫外检测器带 2.5?L 池子 带有样品收集控制功能的变色龙软件是用来设置 Dionex WPS-3000T(B)FC 自动进样器的一些高级功 能.软件收集样品的扩展功能能根据时间和峰的起始点进行收集.在样品富集的实验中可以进行连续或者 部分收集. 自动离线 2D-LC 包括如下过程: 进样 50-250?L 的未纯化的单克隆抗体 / 多聚单克隆抗体 一维亲和色谱(1D):在2.0ml/min 条件下 色谱柱清洗 / 平衡 0.75min 样品洗脱 1min 色谱峰检测后用自动进样器收集到样品盘中 Protein A 色谱柱再生后准备下次进样 总的分析时间 3min 二维分析(2D)(下面二选一): 强阳离子交换色谱,NaCl 盐梯度洗脱(20mM MES 缓冲液,pH5.6) SEC 分离(200mM 磷酸钠缓冲液,250mM NaCl,pH6.8) 样品进入二维分离之前,在收集的样品中添加中性缓冲液(Tris,0.1M)来提高其 pH.由自动进样器准 确控制加入的体积. 图31D 亲和色谱分离 MAb 色谱图(绿色标记峰收集的部分) LC 条件 Protein A 亲和色谱 一维用 AB Poros Protein A 色谱柱(20?m,4.6mm i.d.*50mm,0.8mL),紫外 214/280nm 检测波长. 进样 50-250?L 之间,使用大定量环进样,并采用自定义进样模式. 亲和色谱条件: 流动相 A:10mM 磷酸钠,150Mm NaCl ,pH7.0 流动相 B:50mM 甘氨酸 -HCl,150Mm NaCl ,pH2.8 1D 维梯度:100% 流动相 A 清洗和平衡 0.75min 流速:2.0ml/min 温度:25℃ 离子交换色谱 Thermo Scienti?c MAbPac SCX -10 (4mm i.d. *250mm )色谱柱阳离子交换模式,MES 缓冲液 /NaCl 梯度分离,214/280nm 紫外检测波长. 流动相 A:20mM MES 缓冲盐,60Mm NaCl ,pH5.6 流动相 B:20mM MES 缓冲盐,300Mm NaCl ,pH5.5 2D 维梯度:30min 内15-45%B;