PDF《DGLC-28》

6min 100%B 清洗;

10min 15%B 平衡 流速:1.0ml/min 温度:30℃ 体积排阻色谱 Thermo Scienti?c MAbPac SEC -1 (4mm i.d. *300mm )色谱柱分离蛋白聚体 流动相:200mM 磷酸钠缓冲盐,250mM NaCl,pH6.8 结果和讨论 测定图谱与结果 自动进样器将样品带入色谱柱,在流动相 A 平衡一段时间后,用流动相 B 将抗体粗品从 Protein A 色谱 柱上洗脱下来,同时紫外检测器监测色谱峰,用自动进样器将样品收集在

96 孔板内(图3).通过保留时间 或者色谱峰的信号参数来收集需要的色谱峰,在此过程中需要考虑大概 5S 的收集延迟时间.变色龙软件可 以准确控制收集到样品的体积,然后分别加入样品收集体积 15% 的中性缓冲盐来提高样品的 pH 值. 当自动进样器按照要求对样品进行收集后,软件自动开始进行 2D 的分析.例如二维为强阳离子交换色 谱(样品所带电荷差异);

或者 SEC 根据抗体的尺寸或者聚体大小分离.离子交换色谱图显示重链 C 端赖 氨酸不同亚型的三个较大的色谱峰,同时可以清晰看到一系列碱性和酸性亚型的色谱峰. 由1D 分离完成后,软件自动生成 2D 的测定序列.通过提高流速可提高样品批处理效率,大大缩短 SEC 和亲和色谱分离的时间,同样也可以优化梯度时间来提高 IEC 的分离速度. 加速分析 根据分离的需要,可以优化一些条件.在高通量分析时可考虑缩短色谱柱.或者 IEC 分离时采用 pH 梯 度加快分离速度.IEC 和SEC 快速分离的结果如图 5A 和5B. 讨论 在离线二维分析过程中,双阀 WPS-3000T(B)FC 自动进样器可在较快流速下进行样品收集和再进 样,这个过程可配置不同的分离模式(亲和色谱后接 IEC 或SEC;

RP 和不同 pH 水平的 RP 分离;

SPE 和RPLC);

也可以 IEC 带馏分收集、浓缩或者作为 MS 前端的脱盐处理等.因此该模型可以作为生物医药和 蛋白分析的一个多功能色谱分析技术平台. 同时,变色龙软件可以满足所有的这些应用,并能灵活方便的控制整个过程.包括样品的进样、衍生、 纯化和 HPLC 分析.从而使仪器能够满足样品纯化、HPLC 标准分析和 QC 控制等多方面应用. 图4(A) 2D IEC 分离纯化后 MAb 色谱图 (MAbPacSCX-10,

250 * 4.6 mm i.d.) ;

(B)2D SEC 分 离纯化后 MAb 色谱图 图5(A) 15min 分析时间,2D IEC 分离纯化后 MAb 色谱图 (MAbPacSCX-10,

150 * 4.6 mm i.d.) ;

(B)2D SEC 分离纯化后 MAb 色谱图 (MAbPac SEC-10,

150 *

4 mm i.d.) 参考文献 [1]. Dionex Corporation. Analysis of Monoclonal Antibody Heterogeneity by Cation-Exchange Chromatography: Separation of C-Terminal Lysine Variants. AN 127, LPN1047-01, 2009, Sunnyvale, CA. [2]. Dionex Corporation. Monitoring Monoclonal Antibody Stability by Cation-Exchange Chromatography. AN 128, LPN1052-01, 2007, Sunnyvale, CA. [3]. Dionex Corporation. The MAb Pac SCX-10 Column for Monoclonal Antibody Variant Analysis. Datasheet, LPN2567-03, 2007, Sunnyvale, CA. [4]. Farnan, D.;

Moreno, G. T. Multiproduct High-Resolution Monoclonal Antibody Charge Variant Separations by pH Gradient Ion-Exchange Chromatography. Anal. Chem.2009,

81 (21), 8846C88575. [5]. Rea, J. C.;

Moreno, T.;

Lou, Y;

Farnan, D. Validation of a pH Gradient-Based Ion-Exchange Chromatography Method for High-Resolution Monoclonal Antibody Charge Variant Separations. J. Pharm. Biomed. Anal., 2011,

54 (2), 317-323. ........