PDF《生物大分子纯化经验问答之三》

75 prep grade 凝胶层析, Phenly 柱和 Q sepharose 柱都是梯度洗脱但是最后一直有三条杂带去不掉,现在知道的是我 的目的蛋白和三条杂带在疏水性方面非常接近,跑了等电聚焦电泳可以看到目 的蛋白的等 电点是 5.2,杂带等电点分布在 5.2 到5.8 之间,分子量方面目的蛋白是 47KD,杂带分布在 30KD 到36KD 之间,分子筛也没有分开.想请教 chromatography 兄有没有什么好的建议? 我想把 Q sepharose FF 换成 DEAE 的,希望可以有所改善,如何? 换填料也未必能改善,除非全选择 HP 级别的填料也许会好点,我觉得还是把前面两步改用阶 段洗脱,精细点也许会效果更好 请问填料对缓冲液是不是有一定的选择性, 也就是说, 是不是某种填料用某种缓冲液洗脱效 果很好,换了别的就不大好了?我用 CM Sepharose FF 纯化一种有血清培养的蛋白,做test 时用 PBS 洗脱,只得到一个峰,而且含量很低,我的柱子是够大的呀,怎么没挂上?请指 教,谢谢! 缓冲液选择性是有限的,没太多报导说缓冲液本身影响很大,倒是浓度和pH影响更大,此 外要留意你样品的盐浓度和 pH 值,还有如果样品中别的相同电荷的杂质过多也会导致挂不 上.要不你就换阴柱试试,或者选择更强的 SP 的试试 chromatography 兄:你好!再请教一个问题: Bio-Rad 公司用于凝胶层析的凝胶颗粒有一项 参数如下: typical Hydrated Bed Volume,ml/g of Dry Gel 数值是 12,是否代表每

1 克该凝胶 颗粒经融胀后的体积相当于

12 立方厘米?不知理解是否正确? 应该是吧,不过 Bio-Rad 的bio-gel P 系列颗粒细,刚性差,流速慢,现在应该用的很少,不知道你 说的是哪类填料 请教色谱兄,如何制备 g 级单链 DNA,如polyT,在线等! 关键是怎么制备出来啊? 关键看你的杂质是什么,什么来源的,常规的估计得用离子交换,如果要把双链和单链分离,羟 基磷灰石是比较经典的方法,也可以选择新的球型羟基磷灰石.通过色谱柱纯化出来的: )你 最好还是去查文献,记得中就有关于单链 DNA 的分离.你查查吧 请教一个问题,我要纯化一种大肠杆菌表达的重组蛋白,等电点为 6.2.破菌离心后发现核 酸含量比较高,280 与260 的比值在 0.5-0.6 之间,我想选 用Qsepharose FF 离子交换,缓 冲液用 tris,不知道核酸对吸附和洗脱的影响怎样,或者选用别的分离方法? 如果用阴离子柱,肯定会吸附很多核酸而目标蛋白难吸附,如果可以你试试阳柱,这样也许 会好点,但是前提是你蛋白在酸性条件下稳定 紧急求教:我要把一个单克隆抗体连在一个大分子量的氮杂羧酸(M=400 左右)上,怎么 纯化?用sephdex75 可以吗?我的东西量很少,大约只有 1~2mg 左右,能分离开吗?我很 怕东西丢啊! 最简单的方法是透析,除盐柱也可以,用G25 或别的公司的除盐柱子都可以.超滤离心管也 行,但是蛋白太少怕吸附,回收困难 我是新手,很高兴加入你的论坛!我想问一下,你知道 Dye-Matrix Green affinity chromatography 这种柱材料吗?我也准备纯化酶,希望得到您的指导!谢谢! 其实就是染料亲和填料,不知道你要纯化的是什么酶呢,你多看看文献也许还有别的染料亲和 可以,绿色的用的少,而红色和兰色琼脂糖凝胶比较常见 请问楼主有没有用过聚乙烯阳离子交换树脂?它的预处理方法怎样?使用中的注意事项也 请赐教.谢谢! 没怎么用过树脂,一般都是酸碱处理,然后平衡上样,看看一些实验的书或者文献会有.或发到 中药版问问,好多做天然产物的应该用过,包括做抗生素的 你们有做过谷氨酰转肽酶的吗?我的酶活老是测不好,怎么修正啊!请您赐教! 没做过,只能查文献等相关材料 请问怎样处理树脂才能损失最小?我的疏水树脂处理是这样的,在小烧杯中用碱处理半小时, 然后水洗至中性,然后装柱,但是这样处理发现我的树脂, 损耗特别的大,每次上面都漂浮一层 树脂颗粒,再换液中被到掉了,还有什么好的办法可以减少树脂的损失吗?我这样在烧杯中处 理方法可取吗?有问题吗? 如果你是生物大分子分离纯化的填料,大多不需要特别处理,直接装柱平衡使用即可,很少这 样处理的,你说的情况是因为填料本身不浸润导致上浮,可以加一两滴吐温也许能改善.没见 过疏水树脂是怎么样的.最好问厂家如何处理 我是想问,正常的填料比如 DEAE,CM,疏水上样使用后,每次如何清洗会损失最少,具体的清 洗方法我知道的,我们实验室每次都是在小烧杯里酸碱酸或碱酸碱这样处理的,可是损失太大, 在柱上酸碱处理有时会产热使柱子开列,你有什么好办法吗?你们一般如何处理呢? 对于琼脂糖凝胶系列填料差不多都可以在位清洗,但是对于 sephadex 系列的填料因为柱床 收缩难在位清洗,所以需要在烧杯中进行,前者直接在柱子上清洗 即可,没什么办法,所 以最好选择琼脂糖凝胶系列的填料. 碱处理的时候首先需要冷却, 刚配完的过柱子当然不大 好,此外浓度也别太高,0.5M 应该足够了.此 外可以按我前面说的加点表面活性剂可以避 免填料漂浮和挂壁,减少损失.我也很少用 sephadex 系列填料,所以没这些体会. chromatography 老师:我在做纯化 IgG 的实验,现在做到过 DEAE-52 这一步了,我买了 10g 武汉生命技术有限公司分装的 Whatman 公司的 DEAE-52,批号为