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2、饱和湿度的培养箱中贴壁培养40 min去除MEF. 12. 取出培养皿,轻轻用吸管收集未贴壁细胞(胚胎干细胞)进行下一步.如有必要 可重复上述5-8步骤一次,再次贴壁去除MEF. 13. 计数后调整细胞密度为5.5*104 /mL,接种于60 mm细菌培养皿中,每个皿加入5 mL细胞悬液. 14. 放置于 37℃、5%CO

2、饱和湿度的培养箱中培养

48 h. 15. 两天后可见大小不均匀的球形悬浮状拟胚体,此时大部分拟胚体较小,胚体透亮, 折光性良好,采用离心法(800 rpm离心1 min)换液. 16. 换液后接种于新的细菌培养皿中,放置于37℃、5%CO

2、饱和湿度的培养箱中继 续培养72 h. 17. 在接下来的三天中胚体逐渐增大,高倍镜下拟胚体应透亮紧密,个别拟胚体间可 能会呈现聚集粘连趋势. 18. 拟胚体悬浮培养5天后,800 rpm离心1 min,用拟胚体形成培养基将拟胚体重悬, 将其接种于24孔板,1 mL/孔,共接种8孔,每孔拟胚体数量约10-20个. 19. 连续在37℃ 、5%CO2,饱和湿度培养箱中培养14天,每2-3天换液,观察拟胚体 分化情况,如分化较理想,在分化5-7天时可观察到分化心肌的自主搏动现象. 20. 14天后,用免疫荧光法检测内胚层、中胚层、外胚层的分化情况. 产品稳定性及保存条件 1. 所有试剂均需避光保存. CBPI0149A8 MUXES-90051 Page

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4 2. 拟胚体(EB)形成基础培养基、2-巯基乙醇和非必需氨基酸置于2~8℃保存,保质 期为1年;

其他成分置于-20℃保存,保质期为2年;

完全培养基配制好后于2~8℃ 中保存,保质期为1个月. 3. 所有产品请于保质期内使用,超出保质期,必须放弃使用. 4. 为确保产品质量,请避免反复冻融相关产品. 质量控制 OriCell 拟胚体形成完全培养基已用相应干细胞产品进行性能测试.主要的鉴定 标准包括: ? 无菌检测(细菌、真菌和支原体检测) ? pH检测 ? 渗透压检测 ? 内毒素检测 相关产品 产品名称 货号 OriCell 129小鼠胚胎干细胞 MUAES-01001 OriCell 129小鼠胚胎干细胞完全培养基 MUAES-90011 OriCell C57BL/6 小鼠胚胎干细胞 MUBES-01001 OriCell C57BL/6小鼠胚胎干细胞完全培养基 MUBES-90011 明胶溶液 GLT-11301 Cyagen Biosciences保留OriCell细胞培养产品技术文件的所有权利. 未经Cyagen Biosciences的书面许可,本文件的任何部分,不得改编或转载用作其他商业用途. ........