PDF《表达传染性法氏囊病毒 VP2 蛋白的重组马立克氏病毒的构建*》

258 中国病毒学第21 卷VP2作为IBDV的主要宿主保护性抗原, 已经在 大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒、禽痘病毒、腺病 毒、火鸡疱疹病毒等活病毒载体中得到表达[1~3] . 但在许多表达系统中,存在不能诱导中和性抗体或 不能兼顾高保护力和避免法氏囊损伤的缺陷.因此,VP2基因表达系统的选择对诱导中和抗体的产 生尤为重要. 以马立克氏病毒(MDV)疫苗毒作载体构建活 病毒载体疫苗是近年来禽病毒基因工程研究中比 较活跃的领域[4,5] .而CVI988/Rispens 疫苗是目前 预防 MDV 感染的常规疫苗,对野外强毒、超强毒 和特超强毒的攻击具有较高的免疫保护效力,使用 安全,对鸡及其他动物均无致病性.鉴于此作者选 择CVI988/Rispens 做活病毒载体以表达 VP2 蛋白. 本试验利用PCR以质粒pcDNA3.1-VP2为模板 扩增IBDV-JS 株的VP2 基因表达盒,插入pUC18-US10 转移载体中,与MDV 活病毒同源重 组, 获得了表达 VP2 蛋白的重组 MDV (Recombinant Marek'

s disease virus, rMDV) , 这为进一步研究表达 VP2 蛋白的 rMDV 的免疫学特性奠定了基础.

1 材料与方法 1.1 实验材料 9~10 日龄的 SPF 鸡胚(购自山东 SPF 实验种 鸡场) ,疫苗毒 CVI988/Rispens 株购自北京农林科 学院畜牧兽医研究所北京翎羽禽病防治技术开发 有限公司,液氮保存.pUC18-US10 质粒,pcDNA 3.1-VP2 质粒, 大肠杆菌 DH5α 由江苏省动物预防医 学重点实验室保存.各种限制性内切酶、Taq 酶购 自上海生工,T4 DNA 连接酶购自 Promega,DNA 胶回收试剂盒购自 Qiagen,Lipfectin Reagent 购自 GiBCOL BRL. 1.2 含VP2 基因表达盒的 PCR 扩增 根据 pcDNA3.1 载体序列,设计

1 对引物,扩 增跨幅为 2.42kb,包含 CMV 和ployA 的VP2 基因 表达盒,引物由宝生物公司合成,引物序列如下. P1:TTTGCATGCTTCGCGATGTACGGGCCA;

P2:GTTG CATGCCATCCCCAGCTTGCCTGCTATTGTCTTCCCA A.以pcDNA3.1-VP2 质粒为模板,反应体系 25μL. 具体如下:10*PCR buffer 2.5μL,MgCl2(25mmo- l/L)2.5μL,上下游引物(25pmol)各1μL,dNTP (10mmol/each)1μL, MDV的DNA (5ng/μL)1μL, Taq 酶(2.5U)0.5μL,补充水至 25μL.反应程序: 94℃ 5min→ (94℃1min→55℃ 1min→72℃ 2min) *30 个循环,72℃10min.PCR 产物 4℃保存,1% 琼脂糖电泳鉴定. 1.3 含VP2 基因表达盒转移载体的构建 含VP2 基因表达盒转移载体的构建策略(图1) .即将含 CMV 和ployA 的VP2 基因表达盒插入 pUC18-US10 中,用BamH I 和SphI 酶切鉴定,阳 性质粒命名为 pUC18-US10-VP2,碱裂解法提取、 PEG 沉淀法纯化质粒,并定量,―20℃保存. 图1含VP2 基因表达盒转移载体的构建示意图 Fig.1 Scheme for construction of transfer plasmid vector 1.4 CEF 细胞的转染 取生长良好的原代 CEF 单层细胞用胰酶消化, 以6~8*106 接种到 35mm 的平皿,待细胞长至 80%~90%左右时即可感染和转染.感染病毒量为 200PFU,同时使用 2.5μg 纯化质粒载体 DNA,6μL Lipofectin 进行同步转染.具体操作按 Lipofectin reagent 使用说明书进行,病毒同步感染和转染 12h 后换上完全培养基,24h 换上维持液进行培养. 1.5 重组病毒的筛选与鉴定 待培养至第

4 天, 出现 CVI988/Rispens 病毒蚀 斑,用0.05%胰酶消化细胞,同时接种到新鲜制备

2 块35mm 的dish 上.参照文献[

6、7] 取其中一块进 行间接免疫荧光法鉴定,如果出现带荧光的病毒蚀 斑,另一块接种到新鲜制备

96 孔板继续培养,培养3-4d,再孔对孔稀释到两块新鲜制备

96 孔板继 续培养,3-4d 后取一块固定进行间接免疫荧光法鉴 定,另一块作为筛选阳性克隆的储备板.在96 孔 板中挑选独立的经 IFA 检测阳性的蚀斑继续用