PDF《表达传染性法氏囊病毒 VP2 蛋白的重组马立克氏病毒的构建*》

96 孔板筛选, 如此重复下去直到筛选出表达 VP2 蛋白 刘红梅, 等. 表达传染性法氏囊病毒 VP2 蛋白的重组马立克氏病毒的构建

259 的较为纯化的重组病毒.纯化至第八代时将数十孔 阳性斑汇集起来抽提基因组 DNA,用VP2 引物进 行PCR 鉴定.

2 结果 2.1 含VP2 基因表达盒的 PCR 扩增鉴定 利用 pcDNA3.1-VP2 质粒为模板进行 PCR 反应,扩增出与预期大小相一致的片段 2.42kb,即含 VP2 基因的表达盒,该片段包含 CMV 和polyA 阅 读框(1.05kb) ,VP2 基因为 1.37kb,说明扩增的目 的片段正确. 2.2 含VP2 基因表达盒转移载体的构建 将上述 PCR 产物通过电泳纯化,与经相应酶 切的 pUC18-US10 质粒 DNA 进行连接, 构建出含 VP2 基因表达盒的转移载体 pUC18-US10-VP2 质粒,SphI 酶切可切出 6.0kb 和2.4kb;

用BamHI 酶切可切出 7.7kb 和0.7kb,表明 VP2 基因表达盒 已插入 pUC18-US10 中,插入方向为正向(图2) 序列分析进一步证明 VP2 基因表达盒转移载体构 建成功. 图2pUC18-US10-VP2 的酶切鉴定 Fig.2 Analysis of pUC18-US10-VP2 by RE 1:1kb marker;

2:by BamHI;

3:by Sph I. 图3rCVI988-VP2 的IFA 筛选与鉴定 Fig.3 Screen of rCVI988-VP2 by IFA A: IFA of rCVI988-VP2 on CEF with mAb HNF1 against-IBDV;

B: Plaque of rCVI988-VP2 on CEF. 2.3 重组病毒能表达外源基因 VP2 蛋白 经96 孔板反复筛选阳性克隆,用HNF1 IBDV 单抗为一抗,经间接免疫荧光试验检测,出现发荧 光的呈葡萄串状的 MDV 蚀斑(图3)将第八代阳 性孔的空斑汇集起来抽提基因组 DNA,用VP2 引 物经 PCR 扩增出预期大小的 1.37kb 的VP2 条带, 而感染野生病毒的细胞基因组 DNA 未扩增出条带 (图4) ,表明 VP2 基因成功插入 MDV,并获得了 表达. 图4rCVI988-VP2 的PCR 鉴定 Fig.4 Identification result of rCVI988-VP2 by PCR 1, 1kb Marker;

2, rCVI988-VP2-P8 DNA;

3, MDV CVI988 DNA

3 讨论 当前, 在完善动物生物安全体系的理念下, IBD 疫苗研究正朝着限制弱毒苗使用-优先发展灭活苗、 亚单位疫苗-采用基因工程技术开发无感染性的新 型疫苗方向发展.以MDV 作为活病毒载体构建表 达IBDV-VP2 的载体疫苗是近几年来国内外研究的 热点[8] .尽管构建的这种活病毒载体疫苗可能在相 当长的一段时间里还无法取代传统疫苗,但它们是 今后的发展方向. IBDV 的VP2 蛋白能诱导鸡体产生中和性抗 体,该蛋白表面上至少存在两种病毒中和表位,作 为主要病毒抗原可诱导较强的免疫原性.Chang 等[9] 报道用真核表达系统表达的 VP2 蛋白免疫动物具 有良好的保护作用[9] .Darteil 等(1995)在HVT 的gI 区构建了表达 IBDV VP2 的rHVT,当免疫剂量 为104 和105 PFU 时鸡体获得了 60%和100%的保护 [2] ;

日本学者 Tsukamoto 等(1999 年)用MDV CVI988 株的 US2 区表达 IBDV VP2 基因,接种的 鸡在攻 vvIBDV 后保护达 55%[5] .这些研究结果证 明: 以鸡疱疹病毒为基础的 IBD 疫苗能够安全有效 地表达 VP2 抗原.Tsukamoto 等(2002)还用两种 HVT 重组体 rHVT-cmvVP2 和rHVT-pecVP2 免疫 鸡.后者在体外表达的 VP2 抗原约为前者的

4 倍, 可诱导对致死 IBDV 毒株的完全保护;

而前者只能 诱导 58%保护力[10] .此外,表达 VP2 的rMDV 不 会接触传播,而IBDV 活病毒疫苗却能通过接触传

1 2

3 8000

2500 1

2 3

2000 3000

1000 500 1.4kb bp A B

6000 1500

750 bp

260 中国病毒学第21 卷播[11] . 本试验将编码 IBDV 的主要保护性抗原基因 VP2 插入到细胞结合型的 MDV 载体中,筛选表达 VP2 的重组病毒, 依靠 MDV 感染的形式呈递 IBDV VP2 抗原,在有效抵抗 MDV 强毒攻击的同时,激 发鸡体免疫系统产生抵抗 IBDV 强毒攻击的反应包 括体液免疫和细胞免疫.由于报告基因的表达可能 会干扰重组病毒的免疫效果,因此本试验构建的 rMDV 没有标记基因,直接采用间接免疫荧光的方 法进行筛选.试验表明经过转染后传代已检测到了 表达 VP2 的荧光蚀斑,得到了表达 VP2 基因的重 组病毒, 为进一步研究表达 VP2 基因的重组病毒的 免疫学特性奠定了基础. References [1] Heine H G, Boyle D B. Infectious bursal disease virus structural protein VP2 expressed by a fowlpox virus recombinant confers protection against disease in chickens [J]. Arch Virol, 1993, 131: 277-292. [2] Darteil R, Bublot M, Laplace E, et al. Herpesvirus of turkey recombinant viruses expressing infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 immunogen induces protection against an IBDV virulent challenge in chickens [J]. Virology, 1995, 211:481-490. [3] Sheppard M, Werner W, Tsatas E , et al. Fowl adenovirus recombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induces protective immunity against bursal disease [J]. Arch Virol 1998, 143: 915-930. [4] Sakaguchi M, Nakamura H, Sonoda K, et al. Protection of chickens with or without maternal antibodies against both Marek'