PDF《中的应用》

端标记生物素)和寡 核苷酸探针,实验优化后确定的序列及相关信息见表

1 所示,杂交反应的阳性和阴性质控的探针序列可以 随意设计,与细菌序列不同源即可. 引物和探针均由 英潍捷基(上海)贸易有限公司合成. 1.2.2%%96 微孔板芯片的制备

96 微孔板空白芯片盘 在喷点探针前采用超声波法进行清洗,再用超纯水反 复冲洗五次后使用气枪喷干备用.利用微孔板芯片点 样仪将食源致病菌检测探针在 5*5 阵列中按图

1 所 示位置进行接触式点样,每条探针的点样浓度参见表 1. 点好探针的芯片置于紫外交联仪中进行 UV 照射 30%s 以共价交联固定探针. UV 交联后用 PBS-0.05% Tween20 漂洗

3 次,晾干,密闭真空包装,4%℃保存待 用. 1.2.3%%DNA 的提取 采用煮沸法提取细菌 DNA.首先 取1%ml 增菌培养液加入 9%ml 灭菌超纯水,均匀混和 后即为

10 倍稀释液;

取1%ml%10 倍稀释液置于 1.5%ml 灭菌离心管中,以8000%g 离心 5%min,弃上清;

加入 1% ml 生理盐水重新悬浮沉淀并吸打混匀,再以 8000%g 离心5%min,弃上清;

加入 50%μl 灭菌超纯水重悬沉淀, 置沸水中或干浴器中 100%℃加热 10%min;

然后立即冰 浴处理 2%min 后,再震荡混匀,以8000%g 离心 5%min;

转移上清至新的灭菌微量离心管,-20%℃保存待用. 1.2.4%%多重 PCR 反应 通过一组多重 PCR 反应来扩 增9种致病菌的目的基因. PCR 反应总体积为 50% μl, 其中 5.0%μl%10*Ex%Taq%Buffer% (Mg2+ %Plus),4.0%μl% 2.5%mmol/L%dNTP,0.25%μl%TaKaRa%Ex%Taq%Hot%Start% Version%(5%U/μl),8%μl%DNA,每条引物优化后的加入 量见表

1 所示, 其中还加入扩增细菌 16SrRNA 基因 的通用引物做为 PCR 阳性质控. PCR 反应在德国 Eppendorf 公司 Mastercycler%gradient 型梯度 PCR 热 循环仪上进行,在95%℃热变性 5%min 后进入 PCR 循环,参数为 95%℃ 30%s、56%℃ 30%s、72%℃ 30%s,共35 个 循环, 最后 72%℃延伸 7%min. 反应完成后取 20%μl% PCR 产物用于下一步的芯片杂交实验. 1.2.5%%微孔板芯片杂交及显色和成像 将PCR 产物 利用 PCR 仪在 95%℃变性 5%min 后立即放置冰盒 5% min 待用. 将制备好的芯片(8 孔一排)置于

96 孔芯 片架(类同与酶标板架)上,往芯片孔盘内加入 200%μl 杂交缓冲液(其中加有生物素标记的与杂交质控探针 序列互补的寡核苷酸 DNA 分子) 和20%μl 冰浴的 南方医科大学学报(J%South%Med%Univ)第30 卷418 ・ ・ 图1%%96 微孔板芯片盘及微孔内检测探针的点阵分布图 Fig.1

96 Microwell plate and scattergram of the point lattice in each microwell A1,%A5,%E1,%and%E5:%Positive%control%for%hybridization;

%E3:%Negative% control%for%hybridization;

%C3:%Positive%control%for%PCR%amplification;

% A2:%Detection%of%Staphylococcus aureus;

%B2:%Salmonella spp.;

%C2:% Escherichia coli O157:H7%Stx1;

%D2:%Escherichia coli O157:%H7%Stx2;

% E2:%Shigella spp.;

%A4:%Listeria monocytogenes;

%B4:%Bacillus cereus;

%C4:% Yersinia enterocolitica;

%D4:%Vibrio cholerae;

%E4:%Vibrio parahaemolyticus. Pathogens Direction Sequence%(5'

-3'

Amplicon%size%(bp) Concentration%(μmol/L) Target%gene Staphylococcus aureus F AACACAATGTTTCCGATGCA 123%0.38 R TGTCGGTACACGATATTCTT 0.38 P TCAACATTCATTTATAAAATCG

10 Salmonella spp.F GCTCGTTTACGACCTGAATTAC 239%0.36 invA R AGACGGCTGGTACTGATCGATAATGCCA 0.36 P TTCTACATTGACAGAATCCTC

10 Escherichia coli F-Stx1 TGACAGTAGCTATACCACGTTAC 403%0.6 Stx F-Stx2 GGACAGCAGTTATACCACTCTGC 0.6 R TGATGATGACAATTCAGTAT 0.6 P-Stx1 ACAACACTGGATGATCTCAGTGG