PDF《第 9卷 第3期》

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2 2 ) 第 9卷 第3期1994年

9 月中国病毒学VI RO L O GI ( A SI NI CA f 三D夕Vo

1 .

9 S o p . No.

3 1

99 4 黄地老虎颗粒体病毒 D N A片段 的克隆 与颗粒体蛋 白基因的定位 陈东'

谢天恩1/金锋 ( 中国科学院武汉病毒研究所 . 武汉

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0 0

7 1 ) 5乒弓提要 用pUC19质粒作载 体.克隆了黄 地老 虎颗粒体 病毒( 却幽 a 咖.an1l0si丑v 扛船. 简称 K ~ G V ) D N A P e x I . D . E F . G . H . J .

1 C等 7个片段.以[ P ] - d c r p标记 的油桐尺蠖槎 型多角体病毒 ( 丑珊l・ilnt~lcarpolyl~l r o e i s v i r u s , 筒称 l ~r P v ) 多角体蛋 白基因为探针 . 在37℃条件下对 ^

8 G v ) 颗粒体蛋白基因进行了定位 , 将其分剐定位于 B g

1 I ・ S或T P s T I - A或 B和 E c o K I - A片段上. 关键词 . 堕垫童枣噻墼堡塑堡l罂墼堡隹宴善旱. 杂交-DN克隆黄地老虎颗粒傅病 毒(由踟grmlulosisviros,简称 A s G V ) 最早于

1 9

3 4 年 由法国 P a i l l o t 报道 , 我 国于

1 9

6 ^ 年开 始对该病毒的形 态结 构,组织病理 、 理化性质 , 血清学性质和安全性 试验进行 了一系列的研究 , 并 已开始病 毒制剂的生产与应用叫. 为了进一 步研 究其分子生物学 特性 , 更好地开发利用此 病毒 , 我们将 A s GV D NA 片段克隆到 p U C1

9 质 粒中 , 并从油桐尺蠖核 型 多角体病 毒(awB9口nuclearpolyhedrosisv.咄.简称 B s N W~ ) 多角体 蛋 白基 因为探 针,对AsGV颗粒体蛋 白基因进行 定位 , 结果 报道如 下. 材料与方法

1 A目GV的增殖 毒种由中国科学院动物研究所蔡秀玉研究员提供.以10颗粒体/ 头的剂量溱食感染三齄健康幼虫 , 死亡 率为

1 0

0 %. 收集典型病症的死虫备用.

2 颡粒体的提纯 参照文献嘲的方法进行.采用差速离心和蔗糖梯度离心纯化 A s G V颗粒体.

3 A - s G V I ~I A的提取 参照文献嗍的方法进行.D N A分装于 T E ( p H

7 .

6 ) 中,一2 O ℃保存.

4 D N A酶切 、 电泳与分子量测定 所用的限制性 内切酶及缓冲液均赡于华美生物工程公司( s A B c ) .酶切与电泳方法见文 [ '

】 .以kDlqA・HindI酶切片段为标准按 S

0 u _ r n [ '

] 的方法计算分子量. s DN A s . u t h n吸印硝酸奸维素膜为 s &

s公司产品.s . u n Hn 吸印按 S a m b r o o k 啪介绍的方法吸印

2 0 h r , 在昔通烘箱中 B O ℃固定2hr.车文于

1 9

9 3 年7月22日收到 .

1 0月 4日修回 ・现在地址 . 中国科技太学生物系. 合肥市

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2 6 _ 维普资讯 http://www.cqvip.com

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8 中国病毒学第9卷0探针制备与 分 子杂交 B s l x ~ V多角体蛋白基因重组质粒( p ~

9 1

0 ) 由本室提供. P ~ - d C I P(

3 0

0 0 c i / m r n o

1 ) 购于北京福瑞公司 . N l c k

1 hm1 a n k i t 购自P r o m c g a 公司. 以K P N I 消化 p B S g

1 0 . 用低熔点琼脂培回收其中的

2 . O R b片段( 含多角体蛋 白 基因大部分编码区) .探针制备按 k 扯说明书进行.标记的 D N A用珊dG-50柱层析分离. 严格条件杂交(

6 8 ℃) 按文献【 . 方法.非严格条件杂交 (

3 7 C ) 按How1cy及 S 耵Ⅱlh等方法邙 】 , 甲酰胺浓度为

2 0 ―4

0 , 杂交时间约

3 0 h r . 、 T DN A克 隆及鉴 定 质粒 p I J C

1 9 及受体苗 D H S c ~均 由本室提供.A s O VD N A经Psfl消化后按文甫 的方法进行克隆 .在含 x g a

1 的平板上挑选白色重组苗落, 小规模制备质粒 D N A, 以 A s O VD N A / 黜I作对照进行电泳分l 析.对分子量相 近的克隆片段用 F . a a ~ 消化 , 根据电泳图谱加以区别鉴定. 以P标记的 A V D N A为探针与重组质粒 P a t I 酶切产物进行严格条件杂交( S