PDF《第 9卷 第3期》

8 C) 时.克隆 片段进一步 鉴定 . 结果1AsGV D N A限制 性内切酶 分析 As G VD NA用EcoRI,PstI,Bg1I 三 种限制性 内切酶 消化 , 经0.7琼脂 糖 凝胶 电泳 . 所得 的AsGVDNA三种 限制性酶 切 图谱见 图I.所产生 的片段数分别为

1 7 , u 和23条带 , 各片段 大 小见表

1 , 积加所得 A s G V基 因组的平 均大小为

1 3

0 .

4 k b . 维普资讯 http://www.cqvip.com 第3期陈东等 : 黄地老虎颗粒体病毒 D N A片段的克隆与颗粒体蛋 白基因的定位

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9 圈l^.0vDNA酶切厦颗粒体噩r _ 基因定位圈蹯. 凝胶浓度为 仉7 , 以B s N P V多角体蛋白基四为探针 . 杂交条件为

2 0 甲酰胺 . 0箭头示杂交带. 札^/ l 证1 d &

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8 1 l E Ec

0 l 己IP砒I c 阳性对 照,pmg ]

0 / T I | H I . F 培】Rc加咖pofAsGVD N A( 仉7 a t g r ~e ) a n d t 咄otAsOVD N Ad i g e s t ~ d b y r e s t ~ m∞.Bs NPV p o l y h c ~i n g me∞ e p f 曲e,un 岫theverylowstr/ng~nvyof20妇Hdeat37℃一Co n t r o l , 曲9】0/BamHI.A r r o v ~ w ‰ h咄2颗粒体蛋 白基因的定位 以NP、r多角体 蛋白基囡 为探 针.在20一蚰 甲酰胺存在下 , 于37℃与 A } GVD N A B g l I, P s t I 和EcoRI 片段杂 交.在不 同条 件下 , 阳性对 照均 出瑶 很强 的 杂交带 , 而GV DN A 只在

2 O 甲酰胺 存 在时 出现杂交带 . 分 别是 l I ― S或T. P s t I ― A或B. E c o RI - A带( 图1).3克隆及鉴定 以pUC19质 粒为 载体 克 隆了 As G V DN A P s t I - D, E, F. G, H, J , K 等 7个 片段(图za).其 中D, E 片段大小相近(16.3kb),但两者具完全不同的EcoRI酶切 位点,我们以 E c o RI 对照分析 多个 克隆 (

1 6 .

3 k b ) 片段的 重组 质粒,其中有 两 个具 完全 不 同的 E c o R :酶切图谱 ( 结 果来示出) , 表明D、E片段都被克隆 . 为进一 步鉴 定这些 重组质 粒,以P标记的 A s G V D N A为探针与其 P s t I 酶切 产 物进 行分 子杂交 (

6 8 ℃) , 每个 片段 都 有与 A s G V D N A P s t I 片段对 应的 杂交 带表1AVDNA醢切片段的太小 ( 蛐)

1 1 S i 搁缸噶Iricd柚打曩 窖舯H 曲ofAsGV DN A ( k b ) ( 图2b),表明克隆 片段确 实来 自于 A s G V D N A 讨论包涵体 蛋 白基 因在进 化 中高度保 守,特别是 同类型病毒 问,如苜蓿 丫纹夜 蛾核型多 角体 病毒(幻如ajⅡ~1.uc]carpolyhodr~slsvirus),简称 A c MN P V ) 与BsNPV多角体 蛋 白基 因 的同源性为

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5 r s l , 犬 菜粉蝶颗 粒体病毒 ( 胁 佻妇 埘gfanu10sfsvirus.简称 P b G V ) 与粉 纹 夜蛾颗粒体病 毒(rImvirt~s,简称 T n GV) 颗 粒体 蛋白基 因的同源性 为73,而NPV与GV阿则较低,如AcMNPV与 P b G V, T n G V 阿包 涵体蛋白基 因的同源性 只有58%[

9 ] .我们以 B s N P V多 角体 蛋 白基因为探针 , 在极不严格条件下 (

3 7 ~ C) ,

2 0 甲酰胺 , 将As维普资讯 http://www.cqvip.com

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0 中国病毒学第9卷GV颗粒体蛋 白基 因定位于 B s l I ― S或T, P s t I ― A或 B和 E c o R I A 片段上 - 表明 B s N P V与AsGV【可包涵体 蛋 白基因的同源性 较低. K o z [ o v [ m等分折了 A s G V颗粒体 蛋白的氨基酸序列 ・ 发现 它与AcMNP V和黄 地老虎核型多角体病毒 ( 山舶 脚m n u c l e a r p o l y h ~ c l r ~ v [

1 '

H s - 简称 A s m'

V) 多角体 蛋 自的同源性 较低 , 分别 为59和66,这与本文结果相符 . 通过 A s G VD N A 片段 的克 隆与颗粒体蛋 白基因的定位 , 为颗粒体病 毒基因纽的进一步 研究及 A s G V颗粒 体蛋 白基 因的 序列分析打下 了基础 . 圈2AvDNA片段的克隆与鉴定 . 带头示不完全酶切带. A S为FutI酶切的 A s G V I ~A. B . ^ 鲴vD N A重组质牧的 P 啦!膏切图谱 b . 杂交图谱 , 咀a : p标记的A s O V D N A为撵针. F