PDF《请在使用前仔细阅读说明书》

请在使用前仔细阅读说明书 超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒- WST? 操作说明书 100孔 *本试剂盒(货号:S311)只能用于检测SOD的活性,不能用于检测超氧阴离子(O2 - ) 本说明书提供了下列两种检测方法.

方法 1(检测 SOD 抑制率法) :100 孔可以检测 18-29 个样品. 方法 2(检测 SOD 活性法) :

100 孔可以检测 4-13 个样品. 两种方法的操作和实验结果准确度都有区别,请根据您的具体情况和实验准确度要求选择.如有疑问,请按照说明书下 方的联系方式咨询技术人员. 目录

一、检测机理E1

二、试剂盒内容E1

三、贮藏条件E1

四、所需设备E1

五、注意事项E2

六、样品制备E2 ? 红细胞或血浆EEEEEE

2 ? 组织E2 ? 细胞E2

七、工作液的制备E2

八、操作步骤E2 ? 检测SOD抑制率法E2 ? 检测SOD活性法E3

九、

1 Unit SOD 的定义E4

十、Mn-SOD活性的测定E4 十

一、干扰物质E4 十

二、参考文献E4 检测机理 超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶,它可以催化超氧阴离子(O2 - )的歧化反应,生成过氧化氢和单 质氧. 目前有很多种直接或间接地测量SOD活性的方法, 在这些方法中, 使用硝基蓝四唑 (氮蓝四唑nitroblue tetrazolium , 简称NBT)的一种间接测量方法因其便捷、简单的使用方法而被广泛应用.但是,NBT法存在一些缺点,例如生成的染 料(Formanzan dye)的水溶性较低,会和黄嘌呤氧化酶的还原型发生反应等问题.SOD检测试剂盒- WST ? 提供了更为 简便的检测SOD的方法, 它是利用同仁化学研究所研发的高度水溶性四唑盐WST ? -1 (2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4- 二磺酸苯基)-2氢-四唑盐,二钠盐),能与超氧阴离子(O2 - )反应生成一种水溶性的染料.WST ? -1被超氧阴离子还原的 比率与黄嘌呤氧化酶的活性线性相关,并且会被SOD所抑制(见下图,即红色区域SOD反应优先发生,SOD反应完后蓝 色区域WST-1反应才能发生).因此,SOD或者SOD类似物的IC50(50%的抑制浓度)就能用比色法来测定(同仁化学研 究所专利). WST ? :WST是日本同仁化学研究所的注册商标. 图1. SOD活性检测机理 试剂盒内容 - WST solution

1 ml*1瓶-Enzyme solution

20 μl*1瓶-Buffer solution

11 ml*2瓶-Dilution buffer

10 ml*1瓶 贮藏条件 请在0-5℃下保存.试剂盒在0-5℃下可保存一年.在4℃下, WST ? 工作液可保存2个月,酶工作液可保存3周.请避光保存 WST solution和WST ? 工作液. 图2. WST?-1 甲H的吸收光谱图 在440 nm处的吸光度的变化对应于超氧阴离子 浓度的变化,故可在440 nm下通过检测吸光度 计算SOD的活性. 所需设备 - 酶标仪(450 nm) - 培养箱、96孔板 - 2-20 μl和20-200 μl的可调式移液器、多通道移液器 注意事项 -请使用试剂盒中附带的Dilution buffer或生理盐水稀释样品. -Enzyme solution被分成两层,因此忽略了移液器混合的步骤会导致实验结果的不准确. -为提高实验准确性,建议每个样品进行复孔实验. -酶工作液加入后会立即有超氧化物生成,请用多通道移液器来加酶工作液以缩短时间,减少各孔间误差. 样品制备(其他样品的处理方法详见目录、网站,或者请您以邮件、电话的形式直接联系我们. ) 红细胞或血浆 1. 取2-3ml抗凝处理后的血液(如最终浓度约为10U/ml 肝素钠),0-5℃下,600 g 离心10分钟. 2. 移去上清液作为血浆样品. 3. 加等量的生理盐水(相当于移去的血浆量)至沉淀中,制成悬液.取0.4 ml加入到10ml的玻璃离心管中,加生理盐水 至10 ml,0-5℃下,600 g 离心10分钟. 4. 弃上清液,加入等量的生理盐水至沉淀中,制成悬液.0-5℃下,600 g 离心10分钟.重复此步骤1次. 5. 在沉淀中加入4.0 ml蒸馏水,制成悬液.加入1 ml乙醇和0.6 ml氯仿. 6. 将混合后的液体,盖紧盖子, 0-5℃下用振荡器强烈震荡15分钟. 7. 在0-5℃下,将混合液600 g,离心10分钟,随后将上层水乙醇层小心移入一支新的试管中. 8. 取出0.1 ml的水乙醇层,加入0.7 ml蒸馏水,制成红细胞样品溶液. * 如果进行SOD活性检测,在各稀释梯度的Dilution buffer中需加入乙醇稀释液,维持0.25%的乙醇体系. 组织 (100 mg) 1. 用生理盐水清洗组织,尽可能将血液去除.用纸巾将组织上的水分吸干,然后称重. 2. 加入400-900 μl蔗糖缓冲液(0.25 mol/l 蔗糖,10 mmol/l HEPES,1 mmol/l EDTA,pH 7.4),用Teflon匀浆机将样 品匀浆.如果必要的话,用冰浴器将样品超声粉碎,(60 W,0.5秒间隔,15分钟). 3. 匀浆后的样品,10,000 g离心60分钟,将上清液移入新的试管中,制成样品溶液. 细胞 (HeLa :1x10