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7 个细胞, HL60 :1.2x107 个细胞) 1. 用刮刀刮下细胞.0-5℃下,2,000 g 离心10分钟,弃上清. 2. 用1 ml PBS洗净细胞, 0-5℃,2,000 g 离心10分钟,弃上清.重复此步骤一次. 3. 用匀浆器将细胞破损. 4. 加入1 ml 新的PBS.如果必要的话,在冰浴器上用超声降解细胞裂解物(60 W,0.5秒间隔,15分钟). 5. 0-5℃下,10,000 g离心15分钟,将上清液移入新的试管中,制成样品溶液. 工作液的制备: (供1块96孔板用) WST ? 工作液 用19 ml Buffer solution 稀释

1 ml WST solution. 酶工作液 将装有Enzyme solution的试管离心5秒.用移液枪混匀 * ,用2.5 ml Dilution buffer稀释15 μl Enzyme solution. * Enzyme solution被分成两层,因此忽略了移液器混合的步骤会导致实验结果的不准确. 操作步骤 I.计算 SOD 抑制率的操作步骤: 请见表1,图3及图4. 1) 样品孔和空白孔

2 中分别加入

20 μl样品溶液,在空白孔

1 和空白孔

3 中分别加入

20 μl ddH2O(双蒸水). 2) 每孔分别加入

200 μl WST ? 工作液,混匀. 3) 空白孔

2 和空白孔

3 中分别加入

20 μl Dilution buffer. 4) 样品孔和空白孔

1 中分别加入

20 μl酶工作液,充分混合 * . 5) 37℃培养箱中培养

20 分钟. 6) 用酶标仪在

450 nm 处读数. 7) 按照下面的公式计算 SOD 的抑制率%. SOD抑制率%(对WST-1的抑制率)=[(A空白1CA空白3)-(A样品CA空白2)]/(A空白1CA空白3)*100 * 酶工作液加入后会立即有超氧化物生成,请用多通道移液器来加酶工作液以缩短时间,减少各孔间的误差. 表1. 孔板中各孔的溶液用量 空白1:不含抑制剂的空白对照 ;

空白2:样品空白对照;

空白3:试剂空白对照;

* 如果样品是组织或样品溶液的颜色 较深,必须测定每个稀释样品空白2 的值并扣除. 1) 各孔中加入样品溶液或双蒸水. 2-4)各孔中加入WST ? 工作液,然后加Dilution buffer或酶工作液.5) 37℃培养箱中培养20分钟. 6)用酶标仪在450 nm处读数. 图3. SOD检测试剂盒-WST ? 操作示意图 如果具体实验需要做标准曲线,则需准备SOD标准品,按以下操作进行. 按照下列顺序,用Dilution buffer稀释SOD制备SOD标准溶液.

200 U/ml,

100 U/ml,

50 U/ml,

20 U/ml,10 U/ml,

5 U/ml,

1 U/ml, 0.1 U/ml,0.05 U/ml, 0.01 U/ml, 0.001 U/ml(如果不需要 标准品,标准品的孔可以用来作样品孔用). 图4:以上样品孔和空白孔是按照96孔板的排列 图5. 不同培养时间WST? -1检测得出的抑制曲线 II.计算 SOD 活性的操作步骤: 操作步骤与 SOD 抑制率操作相似,区别是需事先将样品稀释

7 个梯度(图6),然后参考抑制率操作步骤和图

7 进行. 请按照以下步骤用Dilution buffer或生理盐水稀释样品溶液. * 如果您的样品抑制率没有达到50%以上,请增加细胞数量. 稀释比率: 1, 1/5, 1/5

2 , 1/5

3 , 1/5

4 , 1/5

5 , 1/5

6 (见下图,图6. 样品溶液的制备) 图7: 以上样品孔和空白孔是按照96 孔板的排列 注意:可以根据自己样品的情况制 订稀释倍率.

1 Unit SOD 的定义 『

1 Unit SOD 的定义:20 μl样 品溶液中能够抑制50%的WST? -1 和超氧阴离子的还原反应所需的 酶的量.』 SOD活性的计算 请根据附带的光盘中的计算公式计算每个样品的SOD活性. 如果样品之间差异不大, 建议可以先做1个样品摸索条件, 找到50%抑制率左右的2个样品点的稀释倍率,其它样品均按照同样的稀释倍率处理,每个样品只需要做2个稀释倍率 即可,可以多做样品.如果测定的2个样品点的抑制率不在50%左右,则需要重新摸索条件.例如:测得的2个抑制率 分别为60%,75%,则需要进一步稀释样品.反之,则需要增加浓度. 可以测定样品组织蛋白中的SOD活性,用蛋白质定量试剂盒测定样品中的蛋白质含量后换算成U/mg即可,但要注意, 蛋白质定量的方法有很多种,且不同公司之间质量可能有较大的差异,有可能会带来一定的误差. Mn-SOD活性的测定 Mn-SOD活性可以通过向样品溶液中加入氰化钾(终浓度:1 mmol/l;