PDF《系统发育分析》

185 科551 属2599 种,占中国真菌总数的 18.5%[21] ,占世界真菌总数的 2.4%[22] ,这些数据 说明西藏是重要的菌种资源库.近年来,我国学者也开展了一些关于西藏色季拉山真菌资源的研究,刘小 娇等[23] 对色季拉山区红菇科大型真菌进行调查和采集,鉴定出红菇属

15 种、乳菇属

8 种;

邓丽君等[24] 对色 季拉山丝膜菌属真菌进行调查和采集,鉴定出丝膜菌属真菌

16 种. 目前,人们对西藏毛壳属及形态相似属真菌的研究报道还较少,仅刘述春等[25] 对来源于西藏林芝地区 的一株毛壳菌的固体发酵提取物进行了生物活性筛选,发现了新的活性化合物新聚酮类,郭云忠等[26] 对西 藏林芝地区油松和巨柏根际土壤分离,得到

3 株毛壳菌并发现一个新种,他们的研究表明特殊生境是微生 物新种和活性天然产物的重要来源. 色季拉山位于我国藏东南雅鲁藏布江大峡谷西北侧,主峰海拔高度为 5200m,属于藏东南半湿润与湿 润区的过渡地带,其动植物、菌物资源很丰富,是西藏生物多样性最丰富的山体之一.本研究从色季拉山 不同海拔采集植物残体、土壤和动物粪便等标本,进行毛壳属及形态相似属真菌的分离和鉴定,研究色季 拉山毛壳属及形态相似属真菌资源状况,以期丰富西藏毛壳属及形态相似属真菌资源的现状,为筛选西藏 无公害生产的毛壳属及形态相似属真菌的菌株奠定基础.

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本的来源 分离用的323份样品采集于西藏色季拉山沿线2000 m-3792 m海拔高度的土壤、 植物残体和动物粪便等. 1.1.2 供试培养基 [6] 分离培养基为马丁氏培养基,鉴定培养基为玉米粉培养基(CMA). 1.2 方法 1.2.1 菌株分离与纯化 [6] 树枝、树叶、朽木和动物粪便等样品采用组织分离法:将实验材料切取成4~5 mm的组织小块,将组织 小块放入60%的乙醇中消毒6~8 min,无菌条件下用无菌水连续漂洗3次,将组织小块移至马丁氏培养基平板 上,每皿内放4~5块,25 ℃恒温培养,3~4 d后观察结果,解剖镜下挑取单个子囊果接种于CMA平板上,进 行菌株的纯化和观察.土壤样品采用稀释分离方法. 1.2.2 毛壳属及形态相似属真菌的形态鉴定 毛壳属及形态相似属真菌的形态鉴定以 von Arx 系统[27] 和Wang 等[17] 的研究为主要基础和依据, 将毛壳 属及形态相似属真菌的菌株接种于玉米粉培养基(CMA)平板上,28 ℃黑暗培养,定期观察直至子囊果完 全成熟.采用莱卡(Leica)显微镜 DM5000 观察,每个菌株研究和测量

20 个个体. 1.2.3 毛壳属及形态相似属真菌的分子鉴定 DNA 的提取方法主要参考 Nakada 等[28] 的方法,略有改进.ITS rDNA 序列的 PCR 引物对为 ITS1-F (5'

-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'

) 和ITS4 (5'

-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

) , 28S rDNA D1/D2 区序列的PCR 引物对为NL1 ( 5'

-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'

) 和NL4 (5'

-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'

),由北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司合成.PCR 产物的 纯化和序列测定由上海英骏生物技术有限公司用 ABI

3730 DNA 测序仪直接进行序列测定. 将分离到的

29 个菌株的 ITS rDNA 和28S rDNA D1/D2 区序列的测序结果提交 GenBank 并申请接受号 (表1),利用 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)行同源序列查找,选择

18 个所需相关种的序列(表1).用SequenceMatrix(Windows-1.7.8)行菌株 ITS rDNA 和28S rDNA D1/D2 区序列的拼接.利用 DnaSP Version 5.0 软件对序列进行 DNA 多态性分析,分别统计多态位点数目(S)、单倍型数目、序列间每对碱 基的平均差异 (Pi) 、 基因型多样性 (h) 和核苷酸差异的平均值 (k) . 选择小囊菌 (Microascus trignosporus) 为外群,用MEGA4.0 软件构建系统进化树. 表1 构建系统发育树所用菌株 Tab.1 Strains used for constructing phylogenetic tree 菌株号 基物 海拔/m GenBank 接受号 ITS 28S rDNA 2-2-1 土壤