PDF《实验二》

动物总RNA抽提与定量 实验二(1) 实验目的 通过本实验: (1)学习总RNA分离的原理;

(2)掌握TRIZOL法总RNA提取的方法;

(3)掌握RNA的琼脂糖凝胶电泳技术;

并识别与DNA琼脂糖凝胶电泳技术 的区别 TRIZOL 是一种总 RNA 抽提试剂,能够直接从细胞 或组织中提取总RNA.

TRIZOL 内含异硫氰酸胍 ( Guanidine thiocyante) 等物质,能迅速破碎细胞,抑 制细胞释放出的核酸酶. TRIZOL 的主要成分是酚, 主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质 解聚得到释放.酚虽可有效地变性蛋白质,但是它 不能完全抑制RNA酶活性,因此 TRIZOL 中还加入 了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制 内源和外源 RNase. (2) 基本原理 它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性.加入 氯仿后离心,样品分成水样层和有机层.RNA存在 于水样层中.收集上面的的水样层后,RNA可以通 过异丙醇沉淀来获得.在除去水样层后,样品中的 DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式获得.乙醇沉淀 能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉 淀出蛋白. 水样层 (Aqueous) 有机层 (Organic) RNA (Isopropanol) Protein (Isopropanol) DNA (Ethanol) (3) 主要仪器与试剂 ? (液氨罐、研j) ? 一次性手套、微量移液器、Tips、离心管、台式冷冻 高速离心机 ? 微波炉、水平电泳装置,电泳仪、紫外透射仪、分 光光度计等. ? TRIZOL、氯仿、异丙醇、75% 乙醇、DEPC 水、 TAE电泳缓冲液、Goldview、上样缓冲液、琼脂糖等 Diethypyrocarbonate ? 焦碳酸二乙酯 ? covalent modification of histidine (most strongly), lysine, cysteine and tyrosine residues ? Inactivate RNase ? 0.1% v/v DEPC for at least

2 hours at 37oC and then autoclaved (at least

15 min) to inactivate traces of DEPC RNase-free 实验三 总RNA抽提与 鉴定 1) 组织匀浆化: (4) 实验操作步骤 (细节) 各取一管分装好的斑马鱼组织.(助教已统一 准备好:取新鲜动物组织块,剪取,称量.把 样品放入液氮并在液氮里用研钵,研磨棒将样 品磨成粉状.加入TRIZOL ,上下轻摇晃混匀. 离心,上清液分装到小管子, 每管1 ml). (每50-100 mg 组织共加

1 ml 的Trizol.匀浆化 时组织样品容积不能超过 Trizol 容积的10%) 2) 分离阶段 (重复2x): ? 将匀浆样品在 15~30℃ 条件下孵育

5 mins 以 使核蛋白体完全分解. ? 每1ml Trizol 加0.2 ml 氯仿.盖紧样品管盖, 用手用力剧烈摇晃试管

15 secs 并将其在 30℃下 孵育 2~3 mins. ? 在4℃ 以不超过 12,000*g 的离心力高速冷冻 离心

15 mins.离心后混合物分成三层: ? 下层红色的苯酚-氯仿层,中间层白色的变性蛋 白,上层无色的水样层. ? RNA 无一例外地存在于水样层当中.水样层的 容量大约为所加 Trizol 容量的 60%. ? 将500 ml 水样层转移到新管中 (如果希望分 离DNA和蛋白,有机层要予以保留). ? 加 入等体积的 氯仿 (500 ml).盖紧样品管盖, 用手用力剧烈摇晃试管

15 secs 并将其在 30℃下孵育 2~3 mins. ? 在4℃ 以不超过 12,000*g 的离心力高速冷 冻离心

15 mins.离心后混合物分成三层 3)RNA的沉淀(通过将水样层和异丙醇混合): ? 将400 ml 水样层转移到新管中 (如果希望分离 DNA和蛋白,有机层要予以保留). ? 以最初

1 ml Trizol 对应加入0.5 倍体积 (0.5 ml) 的 异丙醇.将混合的样品在 15~30℃ 条件下孵 育10 mins,并在 4℃, 12,000*g 的离心力高速 冷冻离心

10 mins.RNA沉淀在离心前通常不可 见,离心后形成一胶状片状沉淀附着于试管壁 和管底. 4) RNA的洗脱:移去上层悬液.每1ml 的Trizol 至少 加1ml 的75%乙醇.振荡混合样品并在 4℃ 下以不超过 7,500*g的离心力离心