PDF《实验二》

5 mins, 弃上清.(重新放进离心 机轻甩,用白枪头在RNA沉淀对面的位置小心吸掉剩余 的乙醇) 5) RNA的再溶解:盖子打开,把管子放在 55~60℃下孵 育1min.(不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降 低它的可溶性).加入

50 ml 无RNA 酶水(DEPC H2O), 放在55~60 ℃下孵育

5 mins. 实验三 总RNA抽提与鉴定 6) 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA (a) 配制 1.2% 变性琼脂糖凝胶 (40 ml) ? 称取 0.48 g,加入 25.2 ml DEPC 水,

4 ml 5X 电 泳缓冲液, 加热使溶解,稍冷却加入甲醛 3.4 ml, 混匀,室温凝固 0.5-1 h. (b) RNA电泳检测样品制备 ? RNA

2 μl, 甲醛 2.5 μl, 甲酰胺 7.5 μl, 10*MOPS

2 μl, RNA Loading Buffer

2 μl, 灭菌的DEPC 水4μl, (EB). 混合液轻轻混匀并离心,放于 65℃ 下 温育

5 -10 mins 后,立即置于冰上. (c) 将上述样品加入加样孔中,电泳(130V, 100mA)

50 mins.用已知大小的RNA作为分子 量标准参照物 (RNA marker). (d) 电泳结束,将胶置于紫外灯下照像. 为什么要变性胶电泳? 因为RNA分子有

二、三级结构可以影响其电 泳结果,因此电泳时应在变性剂存在下进行, 常用的变性剂为甲醛和甲酰胺. 实际操作 ? RNA甲醛变性电泳改为普通琼脂糖电泳 (DNA) ? 每人电泳样品: RNA

20 ml +

4 ml loading buffer: Load

20 ml ? OD260/OD280在1.9-2.1 视为纯度高的RNA. 如需精确化,只有浓度在

40 μg/ml 以上的 样品适于用光度计测定. ? 如RNA 样品 OD260/OD280的比值太小,说 明有蛋白污染.比值大于 2.1,RNA则可能 被降解. ? OD260/OD280<

1.8,说明有酚和/或8-羟基喹 啉污染 7) RNA的分析和定量: 1) 比较DNA和RNA提取方法,掌握原理. 2) 分析提取的RNA结果,即完整性,产量和纯度. (5) 结果分析 在大肠杆菌中, rRNA 量占细胞总 RNA 量的 75-85%;

tRNA 占15%,mRNA 仅占 3-5%. 真核生物中, 有4种rRNA,分别是5S、5.8S、18S 和28S, 分别具有大约

120、

160、1,900 和4,700个核 苷酸.电泳时,常见5.8S、18S和28S 三条带, 而5S易分解. (6)实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行.非变 性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶,不同的RNA条带也能 分开,但无法判断其分子量.只有在完全变性的条件 下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系.因 此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶.在需快 速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂 糖凝胶即可. 参考:鼎国公司Trizol使用说明书 ? 从组织中提取总RNA 1) 液氮研磨,组织块直接放入研体中,加入少量液氮, 迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如 此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转移 入离心管进行第2步操作. 2) 匀浆:组织样品按 50-100mg/mlTrizol 加入Trizol, 另外,组织体积不能超过 Trizol 体积的10%,否则匀 浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟. 操作步骤 1) 细胞或组织加 Trizol 后,室温放置

5 mins,使其充 分裂解.注:此时可放入-70℃长期保持. 2) ........