PDF《键词 鎏堂 些中 和试验》

1 3

0 0

0 0 g超速离 心2h.沉淀溶于

1 0 mmo l / I P B S中, 加入

2 0

0 mg / mL R N a s e ,

2 7 ℃消化

4 h . 然后 对双蒸 水4℃透析

4 8 h . 除 去残余 Ni ~

4 0 .

3 病毒样品 的电 镜观 察 纯化的病毒样 品经

2 %P TA ( p H6

9 ) 负染 . F一7

0 0 F A型透射 电镜 下观察结果 .

4 蛋 白含量 的紫 外分光光 度测定 纯化 的病 毒及 亚单 位分 别在 uv一3

0 0型 分光光 度上 测定

0 叫及

0 . 光密度 . 并根据

2 8

0 n n l 及260nm下的吸收差求 出蛋白的浓度 .

5 兔抗 G C HV殛其亚 单位血清的镧备 纯化 的GCHV及其亚单位 约100g(样品蛋 白含量 约05g,L)与等体积的福 氏佐 剂混合. 淋 巴结 途径 免疫 家兔. 两 周后 加强免疫 一次. 第二次 加强 后的第 三天采 血, 收集抗血 清.采用 E L I S A法测定抗 体效价.

6 病 毒接 酸的聚丙烯酰 胺凝 胺电泳 病毒核酸的提取 方法及聚 丙烯酰胺 凝胶 电泳条 件 见文献 .电泳后, 凝胶用 E B染色 、 Z D J 一多 功能 紫外 透射 电镜 观察结果 .

7 地 高辛 探针 标记 采用DI G―d UT P ( 德 国宝灵曼公司生产 ) 对2gGC HV c DNA克隆 片段 ( 另文报道 ) 进 行标记. 方 法按 试剂盒操作指 南进 行.标记 的探针经无水 乙醇沉淀 . 真 空干燥后 , 溶于

5 0 I TE缓 冲渡中. 一20℃保 存备 用.

8 斑点杂 交将煮沸变性 的cDN A阳性对照 、 G C H V RN A及亚单 位样 品点于 NC膜上

8 0℃, 烤干 l h . 杂交在42℃条件 下进 行 .杂交赦 舍50%甲酰胺 、 5*S S C 、

0 .

1 %N―L a u r o y L ~ a r c o s i n e .N a ―s a l t ,

0 .

0 2 %S D S 、

1 % B l o c k i n g r e a g e n t .首先进 行4h预杂交 . 以障去非特 异性 物质. 然后加入

1 0 L经 热变性 的探 针,

4 2℃ 杂交过 夜 .杂交完毕. 用01*S S C 、

0 1 %S D S室温洗膜 2冼.

4 2 ℃洗膜 2冼.滤膜用

1 %B l o c k i n g s o l u t i o n封闭

3 0分 钟后. 再加入 D I G抗体 一碱性磷 酸酶 复合 物孵 育30分钟 .洗涤 后. 加入 底物 NB T及X―p h o s p h a t e显色过 夜, 出现兰 紫色 斑点者判 为阳性 . 结果1病毒亚单位的分离

1 .

1 溶液 的离子浓度对完整病 毒结构的影响 将纯化的病毒溶于不同离子浓度的 S S C中(

1 0*S S C-0 .

0 1*S S C) . 一2 O℃保存 . 不同时 间取 样.电镜下 观 察其 变化 .结 果发 现,GC HV在 高盐 及 生理 盐状态下保存,形态结构比较 完整( 图la).而在低盐溶液 中保存. 病毒空壳数量会随判着时间的延长 及冻融次数逐渐增加( 图lb),这一结果可能是因为低浓度的盐溶液会使外壳蛋白子粒松散, 而冻融 则可 以通过物理作 用破坏病毒内部结构, 从而影响病毒衣壳结构的严紧度.

1 .

2 N P

4 0对病毒亚单位分离效果的电镜观察 采用NP

4 0对感 染病毒的细胞 进行 处理 , 经 三次 冻融 和一 次差 异 离心 . 电镜观 察的结果如图lc,d所示 . 从图 l c , d中我 们可 以看 到成 片的结 构 松散 的病 毒双 层衣壳、核心衣壳 ( c ) 及散 在 的子粒 ( d ) . 未 见到 完整病 毒颗 粒 .同 时采 用1%Tr i t o n ―X―1

0 0在相同条件下 处理病毒样品. 视野 中偶 见完整的病毒粒子( 未图示) , 说明同样 浓度 的........