PDF《堕 蔡宜权 柯丽华》

l \ 第 9卷 第 2朗 '

1 9

9 4年 6月 中国病毒学VI R OI 0G I CA SI N I CA 呼、',1.

9No.

2 J u n.

1 g91 草鱼出血病病毒多肽的荧光染色 ' 生.堕蔡宜 权 柯丽 华(-『,Nf

4 ~ 院武汉 病毒 研究所 . 武双 . '

1 3

0 0

7 1 ) s | . 4| } 提要将草鱼出血 府病 毒(GrassCarpHemo r r h a g ~V i r u s . G C W~ ) 置于 还原性 的 溶液 r l 】 - 然后 加凡等体 积的NaHCO3配制的异硫 氰酸荧光 素溶 液进 行 多肽的标 记.再经 S D S - P A GE分析 , 在紫外灯 下 即可检 澳恻GCHV全部 的I1十结 构 多肽的 荧光带 . 该 片法虽 小检测 量500,由浚方'法回收 的多:妻出血 病的病原[.,该病毒系仃效 防治,对各十多肤 的性 质均需深 入分析 , 为此必 须分 离到单 个的 多肽 , 并保 持其 生物学性 质,通常在 蛋白 匝电泳后 进行荧光染色即可,但是 荧光染色试 剂来源不 易,因此我们采用米源较广的异琉氰 酸荧 光素对病毒多肚进行荧光标 记.再进行 S D S - P A GE分析 , 现将结果报道如 r. 材料与方法 l 病毒 草 鱼出血府府毒( G r a s s C a r p H e z n o r r h a g ~ V i r u s , G C H V)

8 7 5由4 实验室提供.

2 多肽的萤光标记 根据异硫氰酸荧光素的特性及影响标记的因素Ⅲ. 将病毒置于还原性的溶液- I ( T r l s . HC L

0 .

2 5 m o l , L , 廿油25.SDS0.086nx*l/L,2-巯基乙醇 .

0 .

3 2 n x .

1 , L , p H6 .

9 ) .

1 0

0 " C保温 3分钟,然后 加 凡等 体积的 I t o o l , LN a H C O

1 配制的异疏氰酸荧光素溶液(

2 m g / m

1 ) , 在 r反应过夜.标准蛋白的标记 方'法同 所述.3多肽 的SD~P A GE 未 标记 的 多肽和异硫 氰酸 必 圯素标记 的 多肽分别在

1 0 聚烯酰胺 凝胶 卜电泳 . 电泳 条件同前文报道 电泳结束后 . 荧光标记多肽的凝胶直接在紫外灯 r 观察 , 未标记多肽的凝胶经考马斯亮兰 染色 . 结果与讨论 I 荧 光标记 的效果 通常 蛋白质的荧 光标记 条件十分 苛刻 , 许多情 况下 的蛋白质不能被 育技地 标记 .因此 , 我 们设计 了将病毒 蛋白在还原条件 下裂解成多肚 , 此 时溶液 p H为 中性 , 不需 要更 换试剂 , 可直 接 加入配 制好的异琉氰 酸荧光素进行标记 . 经SDS―PAGE分 析,标准蛋 白在紫外灯 F 的荧光图 谱与考马期亮兰染 包图谱一致 , 如罔

1 所示 .标记的 G C H V多肽的凝胶 在紫外灯 下可 见到

1 1 本 文于

1 9

9 3 年 4月 l 0日收到 . 9月20I J 修回・国家 自然科学 堇盘 资助 项 目的课题 维普资讯 http://www.cqvip.com

1 5

8 中国病毒学第9卷 图2GCHV多肽的 S D $ - P A G E荧光 图谱 F

2 GCHV Po a y~ i d e S E PAGE 卜1Pa ~ t e r n 图1标准蛋白的 S D S - P A GE图谱 A 荧光标 记IBt考马斯亮 兰染 色 F培

1 S ~md a r d Pr ot e i n S DS - PAGE P a t t e r n s A: F l u o r e s c e nc e l a

0 e l I B! Co o ma s ~e b r mi a nl b l u e s t a i n 条荧光带 , 如罔2所示 , 与病毒结构 多肽组成 一致[

2 ] .由此说 明每种 多肽都 能 仃效地 标记 上荧光索 , 方法是可 行的. 罔 2中病 毒 多肽的 荧光 强度 不一 , 是因 为各多肽 在病 毒 中所占 比例不一 .在实验 中,我们注 意到如果 直接 用完 整病 毒进 行标记 , 则不能 使全部的结 构 多肤 有效 地标 记,尤其是 内 层衣壳 多肽 易被标记,但是 否可 作为研究病毒 多肽在内外 层衣壳 的分布的一种 方法.值得进一步研究完 善.2荧光标记的多肽性质 荧光标记 多肽的 电泳图谱与考马斯亮 兰染色的 电泳 同谱 比较 ( 如同 】 ) , 二者图谱一致 , 各种 多肚迁移率 未 见改 变,说明荧光标 记后 多肽的 电泳行为 未发生可 见的变 化.异硫氰酸荧光索标记 蛋 白质是通过化学键的连接 , 结合 比较牢 同而且稳定 , 其 反应机理 [ 为:荧光索一N―C+N一蛋白质一荧光紊一』n/\HN―c_N 一蛋白质