PDF《大弹涂鱼皮肤黏液的抑菌活性和蛋白质组学》

5 2019 年5月JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA May,

2019 收稿日期:2018-05-22 修回日期:2018-09-30 资助项目:国家自然科学基金(31472279);

浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目(2017R411010) 通信作者:廖智,E-mail:[email protected] http://www.scxuebao.cn 皮肤黏液的分子组成变化机制. 为深入了解大弹涂鱼皮肤黏液的分子组成, 通过电刺激法收集大弹涂鱼皮肤黏液,研究并 比较了其和血清的抑菌活性差异以及鳗弧菌(Vibrio anguillarum)诱导对其皮肤黏液的抑菌活 性的影响.在此基础上,皮肤黏液经脱盐、还 原烷基化和酶解后,采取蛋白质组学策略,结 合大弹涂鱼皮肤转录组数据,研究其蛋白质分 子组成特点.从中鉴定各类蛋白质分子共计97种, 并对上述蛋白质分子开展了序列分析和相互作 用预测.本研究为了解大弹涂鱼皮肤黏液中的 蛋白质分子多样性特征以及大弹涂鱼皮肤黏液 的功能机制奠定了基础.

1 材料与方法 1.1 实验对象 成年野生大弹涂鱼采集于浙江宁波镇海 浦沿海滩涂,体长12~14 cm.大弹涂鱼在装有经 过滤除菌海水的恒温(25 °C)水箱中静养24 h,之 后选取健康、活泼、表皮无损伤的个体进行实 验.采用电刺激法收集大弹涂鱼皮肤黏液[10] .将 大弹涂鱼个体置于盐度为18的经过滤除菌的海水 中,经10 V电压,刺激次数10次(电刺激10 s,间隔10 s)后收集含有大弹涂鱼皮肤黏液的海水,经 离心(12

000 r/min,20 min,4 °C)后,上清液采用 透析袋(Viskase MD44,MWCO:

1 ku,美国)进行 透析脱盐,冷冻干燥后,保存于C20 °C备用. 1.2 大弹涂鱼皮肤黏液的抑菌活性分析 采用打孔法研究大弹涂鱼皮肤黏液及血清 样品对14 种微生物的抑制作用.其中大弹涂鱼 皮肤黏液样品为脱盐冻干后的粉末,将大弹涂 鱼经低温麻醉后,以灭菌注射器收集其血液, 为防止血液凝固,加入红细胞保存液(阿氏液, V(血液)∶V(阿氏液)=1∶4)经低速离心(1

000 r/min,

15 min,4 °C)去除血细胞后获得血清.抑菌实验 所用菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中 心(CICC),5种革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、苏云金 芽孢杆菌(B. thuringiensis)、藤黄微球菌(Microc- occus luteus);

7种革兰氏阴性菌:大肠杆菌(Esche- richia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugin- osa)、荧光假单胞菌(P. fluorescens)、副溶血性弧 菌(V. parahaemolyticus)、哈氏弧菌(V. harveyi)、 鳗弧菌、溶藻弧菌(V. alginolyticus);

2种真菌: 白色念珠菌(Monilia albican)和黑曲霉(Aspergillus niger).将微生物涂布于LB固体培养基上,以打 孔器在平板上打孔,在孔内加入浓度为1 mg/mL 大弹涂鱼皮肤黏液样品,另设大弹涂鱼血清浓 度为1 mg/mL对照组;

阴性对照组为纯水;

上述 样品加样量均为10 μL.平板于37 °C条件下培养

12 h后观察抑菌圈并测量其直径.蛋白浓度定量 采用福林酚蛋白浓度测定试剂盒[C505031,生工 生物工程(上海)股份有限公司],按试剂盒操作说 明进行,标准品为牛血清白蛋白. 采取生长曲线抑制法[11] 分析大弹涂鱼经鳗 弧菌注射诱导后其皮肤黏液的抑菌活性变化.鳗 弧菌诱导参照已有文献[12]进行.鳗弧菌溶于生 理盐水(106 CFU/mL),经腹腔注射(100 μL/尾)诱导24 h的大弹涂鱼经电刺激法收集其皮肤黏液, 经冷冻干燥后进行蛋白质定量.抑菌活性测试 菌株同上.测试菌株溶于LB培养基中(OD600值为 0.01),取80 μL菌液置于96孔板中,加入20 μL样 品溶液(蛋白浓度调节为1 mg/mL);