PDF《大弹涂鱼皮肤黏液的抑菌活性和蛋白质组学》

对照组为80 μL 菌液加20 μL纯水,在37 °C培养箱中培养8 h后, 测量其OD600.去除本底值后,根据样品组与对 照组的OD600比值判断抑菌效果,抑制率高代表 抑菌活性强. 1.3 大弹涂鱼皮肤黏液蛋白质组学分析 大弹涂鱼皮肤黏液样品的还原烷基化、胰 蛋白酶酶解、Shotgun质谱分析参照已有文献[13]. 将大弹涂鱼皮肤黏液样品溶解于50 mmol/L碳酸 氢铵溶液,加入二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT) 至终浓度为10 mmol/L,于57 °C条件下还原1 h, 再加入碘乙酰胺 (iodoacetamide,IAM) 溶液至终 浓度为20 mmol/L,在室温、黑暗条件下进行烷 基化反应45 min.反应结束后,按1∶50比例加入 胰蛋白酶(proteomics grade,Sigma),37 °C条件下 孵育12 h.酶解完成后,样品溶液经离心 (12

000 r/ min,20 min,4 °C)取上清液冷冻干燥后,复溶 于4%的乙腈溶液(0.1% 三氟乙酸)进行质谱分析, 质谱仪为QSTAR-Elite (Applied Biosystems,美国). 酶解后的样品溶液首先经高效液相色谱系 统(20AD HPLC system,Shimadzu,日本)进行分 离;

分离柱为分析型Zorbax 300SB-C18 反相色谱 柱(0.1 mm*150 mm,5 μm,300 ?,加拿大);

洗1272 水产学报43 卷http://www.scxuebao.cn 脱液分别为含0.1%甲酸的5%乙腈溶液(A液)和95%乙腈(B液);

洗脱梯度为90 min内B液的比例 由5%上升到35%,流速为0.3 mL/min.质谱数据 的采集由软件Analyst QS 1.1 (Applied Biosystems, 美国)完成;

一级质谱扫描范围m/z 350~1 500;

分辨率分别为60 000(全扫描)和2 000(MS/MS扫描);

强度最大的8个峰(m/z 100~2 000)经动态排除法收 集后进行序列分析. 采用MSCOT 2.1软件进行蛋白质鉴定.数据 库采用大弹涂鱼皮肤转录组unigene数据集(大弹 涂鱼基因组数据目前尚未开放下载),共计119

848 条unigene序列[14] .上述unigene数据经MSCOT 2.1 软件转化为6种可能的蛋白质翻译格式所推导的 氨基酸序列,构成自定义本地数据库.二级质 谱数据用以检索该蛋白质序列数据库;

质谱质 量容差分别设定为5*10C5 mg/L (一级质谱)和0.2 u (二级质谱);

固定修饰设定为乙酰化,可变修饰 设定为氧化;

蛋白质得分在60分以上且最佳离子 得分(ion score)在40分以上为可信鉴定结果. 对获得的鉴定结果,利用Lasergene v7.1软 件中的EditSeq模块进行开放阅读框(open reading frame,ORF)分析.ORF推导氨基酸序列与MS/ MS质谱图的肽段序列信息进行相互验证,以判 断推导ORF区域以及MS/MS数据的可信度.利用 SignalP 4.1在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)进行信号肽分析;

序列同源检索在NCBI 数据库中以BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)在线进行;

结构域分析用SMART工 具软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线预测;

采用ProtParam在线工具(https://web.expasy.org/ protparam/)分析蛋白质分子的基本理化性质.采用String在线软件(版本v9.05)(https://string-db.org/) 进行蛋白质相互作用分析. 1.4 数据分析 实验数据采用Excel 2013进行整理,采用 SPSS 22.0软件进行统计学分析及显著性差异分析, P