PDF《HI COIFJKLMNOPQRSTUVIW》

1 ) 基因片段作 为分子标记,探索并建立了赛加羚羊角及其易混代 用品的分子鉴定方法,以期为羚羊角的市场监管和 相似羚羊类物种的保护提供可靠的种类鉴定技术.

1 材料与方法

1 1材料 中国北京同仁堂( 集团)有限责任公司提供了

1 份赛加羚羊角片以及 1个储存了

3 0年以上的陈旧整 角;

1个1~ 2年的赛加羚羊新鲜整角由河北省林业 厅提供;

3个藏原羚样品采集自青海省;

2个蒙原羚 标本由内蒙古自治区阿日哈沙特口岸提供;

3个鹅 喉羚样品由新疆维吾尔自治区卡拉麦里自然保护区 提供.其他 C O I 基因序列来源于 G e n B a n k数据库, 见表

1 . ・

8 4

5 ・

2 0

1 3年 7月 第15卷 第 7期 中国现代中药 M o d e r nC h i n e s e M e d i c i n e J u l

2 0

1 3 V o l

1 5 N o

7 表1赛加羚及其易混代用品的分类地位、样品数目及序列来源 中文名 学名 亚科 保护等级 样品数目 序列数目 序列来源 G e n B a n k 登录号 赛加羚 S a i g at a t a r i c a 羚羊亚科 Ⅰ

3 4 本研究以及 G e n B a n k J N

6 3

2 7

0 0 藏原羚 P r o c a p a r ap i c t i c a u d a t a 羚羊亚科 Ⅱ

3 3 本研究 蒙原羚 P r o c a p r ag u t t u r o s a 羚羊亚科 Ⅱ

2 3 本研究以及 G e n B a n k J N

6 3

2 6

8 9 鹅喉羚 G a z e l l as u b g u t t u r o s a 羚羊亚科 Ⅱ

3 3 本研究 藏羚 P a n t h o l o p s h o d g s o n i i 羊亚科 Ⅰ

0 3 G e n B a n k H Q

2 6

9 4

6 1 H Q

2 6

9 4

6 0 D Q

1 9

1 8

2 6 绵羊 O v i s a r i e s 羊亚科

0 4 G e n B a n k N C _

0 0

1 9

4 1 A F

0 1

0 4

0 6 F J

9 5

8 3

4 5 F J

9 5

8 3

4 4 山羊 C a p r ah i r c u s 羊亚科

0 4 G e n B a n k H Q

2 6

9 4

5 2 H Q

2 6

9 4

3 9 H Q

2 6

9 4

3 8 H Q

2 6

9 4

3 7 注: 保护等级:国家重点保护野生动物名录中的保护等级,非名录中物种为空白;

G e n B a n k登录号:从GenBank中下载的序列的登录 号,不包括本研究提交的登录号.

1 2基因组 D N A提取 赛加羚羊角以及藏原羚、蒙原羚、鹅喉羚组织 样品 基因组DNA均采用UniversalG e n o m i cD N A E x t r a c t i o nK i t V e r

3 0( T a K a R a )提取.为验证羚羊 角DNA提取效果是否因取样位置而异,分别从陈旧 整角角尖、中部、根部以及骨塞处采集样品提取 D N A .使用NanoDrop2

0 0 0分光光度计(ThermoScientific)测定基因组 D N A浓度.

1 3巢式 P C R引物设计、P C R扩增和测序 为从低浓度模板 D N A中稳定扩增 C O I 序列,本 研究 根据赛加羚羊线粒体基因组DNA全序列(GenBank登录号 J N

6 3

2 7

0 0 ) 设计了一套巢式 P C R 引物.两对引物分别是: 外引物5COI(Forward:5 ′ T G A G C C G G C A T A G T A G G A A C

3 ′ ;

R e v e r s e :

5 ′ C C T G A G T A G T A G G T G A C A A T G T G

3 ′ ) ;

内引物SaigaCOI(Forward:5′GTAGTCGTAACCGCACAT3′;

Reverse:5 ′ G T A G G A G G A C A G C C G T A A T

3 ′ ) . 引物PCR反应体系如下:1*P C R b u f f e r , M g C l

2 2 0m m o l ・ L -

1 ,4 种dNTP各

0 2m m o l ・ L -

1 ,引 物各

0 5μ m o l ・L -

1 ,E xT a qD N A聚合酶( T a K a R a )

0

0 2 5u n i t s ・ μ L -

1 以及

2 ~

2 0n g ・ μ L -

1 D N A模板.第一 轮PCR反应在

2 0μ L体系下进行,反应条件是:9

4 ℃ 7m i n 预变性,9 4℃

3 0s ,5 2℃4 5s ,7 2℃ 1m i n ,