PDF《红树莓提取物降低油酸诱导 HepG2 细胞脂肪的积累》

10、

50、

100、

200、

300、

500、

1000、2000 ?g/mL 红树莓果提取物,终浓度为 0.

4、 0.

6、

1、

2、

4、

6、

8、10 mg/mL 的红树莓籽提取物, 每组设

6 复孔, 重复试验三次, 加样后继续培养

24 h, 弃上清液,加入 MTT 终质量浓度为 0.5 mg/mL 的无 血清 DMEM 培养液

200 μL,37 ℃继续培养

4 h 后, 吸弃上清液,每孔加入

150 μL DMSO,避光振荡

10 min,使结晶充分溶解,在490 nm 波长处用酶标仪测 吸光度. 细胞存活率/%=A 试验/A 对照*100 式中:A 试验为试验组的吸光度;

A 对照为对照组的吸光度. 1.3.5 细胞脂肪积累模型的建立 采用 DMSO 带入油酸(A)和蛋白吸附(B)[16] 两种方法制备油酸造模剂.油酸造模剂 A 的配制:吸 取油酸 0.318 mL,在无菌通风避光环境下加入 0.682 mL 100% DMSO,反复吹打,直至油酸完全溶解于 DMSO 内, 配成

1 mol/L 的油酸造模剂, 0.22 μm 滤膜 过滤除菌

4 ℃保存备用;

油酸造模剂 B: 吸取油酸

100 μL,于70 ℃水浴中边振荡边将油酸溶于 3.06 mL 0.1 mol/L NaOH 中, 配成

100 mmol/L 储备液;

称取 2.844 g BSA, 加PBS 溶液 28.44 mL 溶解, 配成浓度为 10% 的BSA 溶液;

于55 ℃水浴中边振荡边将上述储备液 逐滴加入 10% BSA 溶液中,配成油酸浓度为

10 mmol/L 的溶液,0.22 μm 滤膜过滤除菌,-20 ℃冻存 备用.临用时用含 1% FBS 的DMEM 培养基稀释至 所需浓度. 将HepG2 以每孔

200 μL、 细胞密度 5*104 个/mL 接种于

96 孔板中,培养

24 h,待细胞贴壁后,吸弃培 养液,设置对照组和模型组(MC) ,对照组加含 1% FBS 的DMEM 培养基,模型组加用含 1% FBS 的DMEM 培养基配制的终浓度为

100、

200、

500、

1000、

1500、2000 μmol/L 的油酸造模剂,每组设

6 复孔,重 复试验三次,分别测定其 MTT 值、TG 含量及脂质含 量. 1.3.6 红树莓提取物干预试验 细胞消化,计数,按每孔

2 mL、细胞密度 1*105 个/mL 接种于

12 孔板中,培养

24 h,设对照组、模型 组(MC)和试验组;

对照组加含 1% FBS 的DMEM 培养基,模型组加用含 1% FBS 的DMEM 培养基配 制的终浓度为

1000 μmol/L 油酸造模剂 B,试验组在 与对照组相比无显著性差异范围内,选择红树莓果和 籽提取物的三个适当浓度 (需要根据 1.3.4 结果确定) , 加入用含 1% FBS 的DMEM 培养基配制的终浓度为

1000 μmol/L 油酸造模剂 B 和相应浓度的红树莓提取 物.培养

24 h 后测定细胞内 TG 含量及脂质含量. 1.3.7 油红 O 染色 按1.3.

5、 1.3.6 处理后, 吸弃培养液, 加2mL PBS 溶液清洗细胞, 吸弃 PBS, 加入

2 mL 10%中性福尔马 林溶液室温放置

10 min,换新的 10%中性福尔马林溶 液室温放置至少

1 h, 注意密封. 吸弃中性福尔马林溶 液, 以2mL 双蒸水洗细胞

2 次, 加2mL 60%异丙醇, 室温放置

5 min,吸弃异丙醇,室温放置或者电吹风 小心吹干细胞.每孔加

1 mL 油红 O 工作液,室温放 置10 min, 弃去油红 O, 马上用

1 mL 双蒸水洗细胞

4 次终止染色,吸弃双蒸水后,放置待细胞干,每孔加

1 mL 100%异丙醇,轻柔摇晃 10~15 min 使染剂充分 溶解,选择

490 nm 波长用酶标仪测吸光度,计为脂 质含量[10] . 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2019, Vol.35, No.2

27 1.3.8 TG 和蛋白含量的检测 按1.3.

5、 1.3.6 各组处理后,吸弃培养液,用PBS 小心洗 2~3 次,加入 RIPA 细胞裂解液,充分裂解后,