PDF《色谱柱常见问题解答》

色谱柱常见问题解答 FAQs for column users By CSD AEs PDF created with pdfFactory trial version www.

pdffactory.com 1.液相色谱柱柱压升高问题 造成柱压升高的可能原因有很多. 一般是由于色谱柱筛板或柱头发生了堵塞, 造成流动相阻 力加大所引起.当然色谱系统其他部分发生堵塞,也可能表现为柱压(系统压力)升高.所 以在发现系统压力升高时,可首先使用两通短接色谱柱观察相同条件下系统本压是否正常, 排除压力升高为系统其他部分造成. ? 色谱柱筛板堵塞, 这往往是由于流动相没有过滤, 或虽已过滤但滤膜孔径过大或滤片损 坏,使固体杂质滞留在筛板上造成的.可采用反冲的方法去除堵塞物.对于

5 或3.5um 填料的色谱柱,建议采用 0.45um 膜厚过滤样品,1.8um 填料的色谱柱,请采用 0.2um 膜厚过滤样品. n 同样类似堵塞也会发生于排气阀过滤芯、 在线过滤器和保护柱, 这时建议更换滤芯, 在线过滤器内的筛板或保护柱内的柱芯. ? 非特异性吸附 当部分组分在柱子上有较强的非特异性吸附,且当前所用的流动相难以 将它们洗脱时, 强保留组分的累积则会造成阻力增大和压力升高. 可使用适当的溶剂冲 洗以除去吸附物质. ? 样品的沉淀 当样品所用的溶剂与流动相不一致时,样品进入柱中时有可能因溶解度降 低而沉淀出来,造成压力升高.此时建议使用对样品有较高溶解度的溶剂冲洗. ? 盐晶体的析出 使用较高浓度的缓冲液或添加有缓冲液的流动相后,如果冲洗不彻底, 缓冲液中的无机盐成分可能会残留在体系之中. 它们会因在新流动相体系中溶解度降低 而析出,造成流动相阻力加大,压力升高. ? 更换流动相时置换不彻底 当改换流动相体系时,不彻底的更换使不同性质、互不相溶 的流动相存在一个体系中, 也会造成压力升高. 可使用混溶的溶剂 (异丙醇) 彻底冲洗. 备注: 安捷伦液相色谱柱冲洗建议 反相色谱柱 用以下溶剂至少各 25mL 冲洗色谱柱(分析柱) ? 不含缓冲盐的流动相 ? 100%甲醇 ? 100%乙腈 ? 75%乙腈+25%异丙醇 ? 100%异丙醇 ? 100%二氯甲烷 * ? 100%己烷* *若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱, 则在重新使用反相流动相以前, 必须用异丙醇冲洗色 谱柱 !!! 正相色谱柱 用以下溶剂至少各 50mL 冲洗色谱柱(分析柱) ? 50%甲醇+50%三氯甲烷 ? 100%乙酸乙酯 除有特殊说明外,安捷伦的液相色谱柱在柱头发生堵塞时可以反冲. PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 2.液相色谱柱保留时间变化 保留时间不重现可能由多种因素引起, 通常还会影响到峰面积的重现性, 建议检查以下几个 方面: ? 确认流动相是新鲜配制的,比例没有错误.比如一些挥发性的溶液,如乙酸,最好及时 更换. ? 确认色谱条件在色谱柱使用范围之内,如pH 范围、温度、压力. ? 仔细观察柱前压的变化,如果压力稳定,就可以判断泵的系统没有问题;

如果是压力不 稳定,一定会影响保留时间,这种状况通常是由于泵头里有气泡造成的.请将流动相仔 细脱气,并排出泵内气泡. ? 观察色谱峰形、柱效变化情况,确认色谱柱是否被污染,如果确定色谱柱污染,可尝试 使用适当溶剂冲洗. ? 如果同时伴有色谱柱柱压升高,解决方法请参见 液相色谱柱柱压升高 部份. ? 如果使用梯度洗脱方法,请确认平衡时间足够长.流动相中使用离子对试剂(烷基磺酸 钠等)或固定相为正相硅胶等,往往需要更长的平衡时间. ? 确认样品是否过载,减少进样量(进原进样量的 10%确认) . ? 组分在色谱柱中保留不够.调整色谱条件,使样品在柱上适当保留. 3.气相色谱峰拖尾、响应低甚至不出峰的主要原因 A) 系统污染、惰性下降 系统惰性不好对活性组分峰形及响应的影响尤为明显.建议选用惰性优异的低流失色谱 柱和色谱耗件,如去活的衬管.如果系统已经被污染,应及时对进样口和检测器进行维护. 恢复被污染色谱柱的方法主要有: 将进样口端截去 0.5~1 米,根据样品来源做进一步的判断,如果是半挥发污染物, 还可以进一步考虑对色谱柱进行老化. 污染严重时可截去更长或用溶剂彻底清洗色谱柱(必需是交联键合固定相) B) 色谱柱安装不正确或系统其他部位存在死体积 毛细管柱在进样口和检测器的安装位置不当将影响峰形,请严格按照仪器的使用说明正 确安装色谱柱.其他与毛细管柱相连接的部位也应注意降低死体积. C) 系统漏气 需定期检查系统气密性、更换进样口备件.使用非纯石墨密封圈时,注意安装后的几次 温度升降之后追加一次拧紧. D) 方法条件不佳 对于低挥发性样品,需注意提高进样口和/或检测器、色谱柱、传输管线等处的温度,防 止冷凝现象. PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 有些样品在某些检测器的响应确实不高(甚至没有响应) ,如果样品不出峰,又没有参 考响应值,应加大进样量确认出峰位置,并利用标样考查样品的响应值. E) 其他可能导致峰拖尾的原因: ? 不分流模式下,分流放空阀开启过晚(通常应在 0.5~1.0 分钟之间) ? 手动进样速度过慢 ? 检测器尾吹气流量不足 ? PLOT 色谱柱样品过载 ? 组分共流出 ? 含磷化合物在 NPD 白色铷珠上易拖尾,建议使用黑色铷珠. 4.液相分析样品前处理 进样上柱的样品必须是可重现的均质溶液, 样品前处理是为了尽可能除掉对分析有干扰的杂 质,保证好的重现性及不损害色谱柱,且能与 HPLC 色谱条件相兼容. A)溶剂 溶解样品的溶剂应该能溶于流动相而不影响样品的保留值和分离度, 最好使用流动相溶 解样品或使用比初始比例流动相洗脱能力更弱的溶剂来溶解样品. 当样品所用的溶剂与流动 相不一致时,应避免样品进入柱中时因溶解度降低而导致沉淀. 未溶解的或含颗粒物的样品溶液会造成堵塞,进样前一定要使用合适的滤膜过滤. B)进样量 在分析级色谱中,加到色谱柱上的样品量一般是 ug 水平,也可以更少.如果样品溶液 浓度过大,可通过稀释降低溶液中被测物的浓度,以避免色谱柱超载或检测器超限.进样体 积也应该尽量小,避免由于体积过载对分离造成不良影响. 为了适应检测灵敏度的需要,某些痕量分析需要将样品浓缩、富集. C)样品纯度 可根据样品性质和分离目的,使用固相萃取(SPE) 、溶剂萃取等其他样品前处理手段, 最大程度去除干扰物质或色谱柱 杀手 干扰物,达到纯化和富集目标化合物的目的,同时 延长色谱柱使用寿命. 组分非常复杂的样品往往需要预分离为简单的片段避免色谱峰过分重叠. 5.气相分析样品前处理 气相色谱所能分析的样品应是可挥发的、且是热稳定的,沸点一般不超过 500℃. A)样品要求 GC 能直接分析的样品必须是气体或液体. 固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中, 或是通过特殊的进样技术(如顶空进样和裂解进样)进行间接分析. PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 直接分析的样品要保证样品中不含不挥发的组分 (如无机盐) 或可能损坏色谱柱的组分 (如无机酸和碱:盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、全氟酸、CrO