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7 一弓第10卷第4 期I995年12月中国病毒学VI R 0L O GI CA NI CA 占77}V0I.

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0 N o.

4 D e c. 【

99 5 丙型肝 炎病毒核心抗原高效表达 及产 物抗原性 的研 究张生旦旦塑刘克李河民 ――――――一―――――-. y ( 中国药品生物制品检定所, 北京1

0 0

0 5

0 ) R ≥

2 { 提要 用含 谷胱甘肚 转 硫酶 ( GS T) 基 因的 p Ge x 一2T为表达 载体 在太肠杆 菌 中高教 表达 r含HC V 核心区部 分基因片段 ( 约122个氨 基酸)的融合 蛋白, 表达产物 c 趱测定占茵体 总蛋白的

3 0 % , c 纯 化后 , 用我国HC V 诊 断试 剂第 二 代血 清参 考品为标准 与C核心抗 原进行比较 , 结 果显 示二者具有 相同的总体 检曲 率 和近 似的 抗原活 性.因此 , 推测 表达 的部分 区段 基 因可能 是核 心 区重 要功 能HC V E I A 诊 断试 剂的灵敏 度有 重要 作用.目前 , 国内 已有 成功 获得HC V 核 心抗 原的 报道.国外试 剂中, 已在 使用 且质 量较 好 的核 心 区抗 原有日本 东燃 公司的C.抗原 和美国Ab b o t t 公司的 C

2 2 抗原. 本研 究甩含谷 胱甘肽转硫酶 ( GS T) 基 因的 p Ge x 一2T为表达载 体,利用肠杆菌 系统 融合表达 了HC V核心 区部分 基 因片段 , 并利用 国家 HC V 诊断试剂 第二代参考 品对 纯化后抗原的活性 进行研究和 比较 材料 与方法 I 基 因片 段、襄选 质粒 和宿主营 基因片段 p H C V― E是从2

1 6 n t 至755nt,由我所 工作 人 员刘克 在美 国从中茸几血 清 巾克 隆,详情 请 参阅 文献 . 表达 质粒 p Ge x -

2 T 赌自pharrnacia公司 , 宿 主菌 .

0 6 由巴斯 德研 究所惠蹭

2 工 具酶 、 层析 介质爰所 用试 剂分别赌自P r o me g a , P h a r ma c i a, S e l '

v a S i g ma及北京 化T.J一和 协和 友谊开发公司.3基因重 组,SDS-PAGE电泳 , 免疫印 迹爰EIA方法检 测 均按 文献 I S ] 进行.的诱 导 衰选 用Ac c I . e l a I 酶切pHC V- E, 回收

3 1

6 ~6

9 6 n t 的小片段 , 用修饰 酶切平两 端后 , 插^用Sina i 切开的pGex一21 表达质粒 ( 如图1),转入宿主菌 , 筛 选后 , 接种于新 鲜LB一氨苄(含01mg/mt 氨苄)培养基中,37℃振 荡培 养过液 后,l;

lO稀释 于新鲜 L B 一氨苄培 养基,37振荡培 养I小时,加八1PT G( 终浓度0 .

1 mm o l / L ) 诱导7小时 . 离心 收 集茵 体.牟文 于1995年1月1

6 E l收到 .

5 , q1

0 日修 回 维普资讯 http://www.cqvip.com

3 8 中曾病毒拳第l0卷图1 表达质粒pHc 构建图Fi g 】 T h e e o m t r u c t i o n t h e e xp r e s s i o n p l n a m i d p H C~

7 5 表达 蛋 白纯 化沉淀后 菌体 用PBS(pH7 .

3 ) 洗三次,悬浮振 荡洗 涤后,于4 C离心 洗涤 悬液,弃上清 , 沉淀 茁体再 用PBS悬浮, 振荡洗涤, 然后离心, 如此反复洗涤三次 . 洗涤后 菌体 悬浮于适量裂解液中(

2 0 蔗糖 ,

5 0 mmo l / L Tr i

8 . HC I t l O mmo l / L E D TA,0 .

8 5 Na C

1 ,

1 mmo l / L P MS F,o H7 .

3 ) t 室温 静置1O分后 . 冰 浴超 声破碎苗 体.然后于4℃高 速离 , b1

5 5 - ~ , 将上清 蔽弃 掉,沉淀分别 用含

1 T r i t o n X1

0 0 和3mo l / L尿素的洗液 洗涤,洗涤方法同上. 洗涤悬液于4 C 高速离心 . 弃上清 , 沉淀用古8 m o 帆 尿索 的溶液溶解. 然后分别用离于变 换(DE AE) 和分子筛 ( s ・

2 0

0 ) 柱 层析纯 化.纯化后 魏 蛋白浓 缩后 待用 . 用激光 扫描 仪测 定纯 化 后蛋 白的 S D S . P A GE电泳 图.显示 其纯 度达 到95.6纯化 抗 原的 E I A检测纯化表 达 抗原 与Cn 抗原(全棱tL-基因的重 组抗 原,购自北 京 生研 所.由日本 东燃公司生 产,Mw ―l