PDF《中国病毒学》

1 猪瘟 病料

1 9

9 5年 7月和

1 9

9 6年 1月长春市郊 区和吉林 市效区某 猪场 分别送 来病 猪, 临床症状 、 病 理剖 检均 被诊 断 为典型 的急性 猪瘟 , 免疫荧光染色 、 电镜 负染均 为阳性 .选 择脾或淋 巴结作 为PCR检测病料 .

2 病毒RN A撮取 采用 异硫 氰酸腻一步法从猪 瘟病 料( 脾或淋 巴结) 中提取 总RNA.

3 引物的设计 与台成 根据 HC V A l f o r t 株Ⅲ 与Brescia株 圳的基因组 序列 . 化学 合成 一对简 并引 物.其中 引物 P e

0 5 端后l9个碱 基位于 B r e s c i a株的

2 4

2 8 ~2

4 3

6 . P aⅢ l 【 位于 B r a s c i a 株的29923011.Pe05CAT ~ A G C C T G c / t A A G GA AG

3 P a

5 G TC A C T G Gt / g T C G C C T T Tc / t A C

3 4 R T―P C R 取适 量HCVRN A. 分别加入 引物 、 反 转录 酶 缓冲 液、dNTP、 RN a s i n和AMV( P r o m e g a ) ・

4 2 ℃水浴1h.再取适 量反转录产物 , 加入 引物 p e

0 、 P a等按 常规方法 以95℃ I r ai n 、

3 7℃

2 r a i n 、

7 3℃ I r a i n 、 1个循环 , 随 后以

9 5℃

4 0 、

5 1℃ 1mi n ,

7 3 ℃

1 mi n .

3 5个循环, 最后

7 3℃延伸

1 Or ai n .扩增产 物于

2 %琼脂糖凝睦上进行 电泳 .

5 扩增片段 的克隆和 序捌分析[ J l 用标 准方 法将扩增片段纯化后或直接克隆劐pGEM―T载体(按Prome g a 操 作说明进行 ) .克 隆后用 P r o me g a T a q测序试剂 盘或 P h a r ma c i a 铡 序试 剂盘对 扩增 片段进行序 列测 定.

6 桉苷 酸与善 基酸的序列对 比与分析 将 测得 的棱苷酸序列 与推 导的氨 基酸 序列与 其它 H C V株进行 同源 性 比较, 根 据各 HC V株的 核苷 酸序刊用 D N A s i s 计算机分析软 件( Hi t a c h i S o f t w m mE n g i n e e r i r ~ gC o . L t d ) ~ 行系 统树 分析. 结果1长春 、 吉林两个野毒株的核苷酸和氧基酸序列 琼脂糖凝胶电泳表明, 以Pe0,Pa为引物 用RT―P C R法成功地从长春 、 吉林两地 收集的 猪瘟病料提取 的RNA中扩增出了与预计大小(

5 8

8 b p ) 相符的片段( 电泳圈略 ) .将PCR产物 直接克隆到 p G E M ―T载体 中, 然后用双脱氧 法进行 寰1 } I c 、 糠的毫奢跫G e n B 董晕 了序列测定.核苷酸序列测定结果见图l . 由核苷酸Off:】=:序列 推导的氨 基酸 序列见图

2 .

2 核苷酸和氧基酸序列比较 将测得 HC V 长春、 吉林野毒株 序列中的5端350bp及其编码的氨基 酸序列( N端116aa)与国内外 已知的其它 HC V毒株相 应序列进行同源性 比较.各毒株来源 及在GenBank中 的编 号 见表 l , 同源性比较 结果见表 2和表

3 .最后我 们根据 各HC V株的核苷 酸序列用 DN As i s 计算 机软件进行 了系统树分析, 结 果见图

3 .结 果表明 : 这 两个野毒株的核苷酸序列及 氨基酸序列, 与1985~1

9 9 2年意大利 中部分离的 4个 野毒株的同源性 明显高于其 它HC V毒株, 它们归于 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第l2卷 同一基因型, 而我国的 HC V标准强毒石门株刚位于另一基因型

1 A C r A C A G A TA ~ A T A T C A Tc 从他M掩^o^T^00B 丌O^00G0cr

1 … … - G. . - C… . - I … … ・ C… ・ G… … 5I OA A G GT Cr C A 0c ^ C T ^ C^ I B G A A A GA A TA C A G CC A T ~ Tr H ^

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