PDF《满林丁建》

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L}第ll卷第

4 期1996年

1 2月中国病毒学VI ROL OG I CA S l NI CA 二)vd .

1 1 No.

4 De c.

1 996 伪狂犬病毒蛋 白激酶基 因的 P C R扩增及其克 隆鉴 定罗满林丁建华、/王家富张楚瑜 58:6――_-――一一(武投大 学翁毒 系. 武投43OO72)提要以BHK~2 1细胞 单 层上增殖 的 伪狂太 病毒(Pse.uiorahlesvirus,PRV) , 经离心浓 缩后.用SDS-蛋白酶 K 消化 法- b i t g 纯化PRV基 因组 DI q A 参照PRVKa 株和NI A一3株蛋 白蠢 酶(PK) 基因的DN A序列.设计并合成 了一 对长度 为26t , p和32t , p的 引错 . 阱纯 化的 P RV基 因组 DN A为模 板,用PCR技术 成功 地扩 增 出我 国伪狂 太病 毒地方 株的PK基 因. 并将 它 克喜 于pUC1 9载体.酶切分析结 果 表明 , 所获PK基 因克 隆在 P 毒tI、 S ma I、 X I mI和sI上 的切 点与 P RV NI A一3株框的传染病 .本病对猪 的危 害最 为严重 , 两周龄 内仔猪致死率 可高达

1 0

0 %. 成年 猪可 发生呼 吸 系统感 染症 , 康复猪可潜伏感染 , 终 生带 毒, 母猪繁殖障碍等. 给我 国及世 界养猪业造成 巨大经 济损失… . P R V属于疱疹病毒科 a 一疱疹病 毒亚 科的成 员, 为双股 DNA病毒.病 毒基 匠组 长约150kb,其G+c含量 约为

7 2 ~ , 6. 目前, 国外 已对 P R V 的多个基因进行 了定 位和澍序1 .与 单纯 疱疹病毒 I型( HS V一1 ) US . 3同源的 P RV蛋白激醇 ( P K) 基因是病毒增殖的非 必需基 因, 同时 又是 P RV重要的毒力基 因l

3 】 .本研究根据 国外 已确定的 P K基 因序 列[

4 . , 设 计并合 成 了一 对引物, 成功地 从我 国PRV地方株 中扩增 了PK基匠 , 并将 其克隆于质粒载体 , 从 而为我 国研 制PK基 因缺失疫苗奠定基础 . 材 料和 方法

1 P R V '

- 麓与 D NA提取 P RV 由湖北 省农科 院畜牧 兽 医研 究所提 供 .将 P RV种 毒接种 于长 好 单层 的BHK一2

1 细 胞上 , 培养

1 ―

2 d , 当80%细胞 出理 C P E时.3OOOr/m/ n除去细 臆.将上清锚 于如%蔗糖 垫上.14000r/m/ n离心1h.收获 病毒沉淀 物 .用 TNE (

0 . 1m o t / LTr i s ・ C I . p H8 .

0 ;

0 .

1 mo t / LNa C I ,

0 .

0 2 5m o t / LE DT A) 蠹浮后,用蛋白酵 K( 终 旅度

1 O 0~ g / mL ) 和0.5%S DS裂解病 毒粒 子. 使释 放出 DNA后,再苯 酚、氯仿 抽提 , 乙醇 沉淀2PCR扩'

-P K基因模板:以纯化 的PRv基 因组 D N A 或经 线性化 处理 的重组 质粒 DN A. 本文 干1996年 2月 5日收 蓟. 5月14日修 回・中国 博士 后科学 基垒资 助谭题 ¨ 联系 怍者 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 罗瞒# 等:伪狂犬 病毒 蛋 白蠢 酵基 因的PCR扩 增及 其克 隆鉴 定361引物 设计 : 根据引物 设计 基本原 , 参黑国外已发 表的PRV P K基因序列, 选择比较 保守的区域 设计并合 成 了长度 分 别为

2 6b p和32的一 对 引物 <

由中科 院上 毒细 胞所 合成).引物 同包 括 具有 两十转录起始区的完整 P K 基因. 引橱 问跨 距约1.3k b . - 反应 液戚 分:摸扳 量5o~1

0 0廿g.引物 各50p m L 4种dNTP

2 5

0 T n d / L . DMS O

5 L . 酵1.5单位 . 反应 体积

5 0 山 所用 P CR试 剂盒 为 华美 生物工 程公 司产 品. 扩增条 件;

摸扳 与引 物先 在沸水 中瑗 盎性

5 r n l n . 加入 T a q酵和 石螬油后在 水浴式DNA扩 增便 上 进行 如下2轮 循环:℃.50s;

58℃.90s;

72℃.180s;

I;

l后35轮 循环 时遢火 时 问改 为6o搴 , 延伸 对 同改 为150搴 , 末攻循环 的 延伸时 同为1Om/ n .反应 完毕 后. 琅5~8皿样品电泳分 析.3PRV P K基因的分子 克睫将PCR扩 增产 物和 p UC1 9质粒 D NA用EcoRi/ B 蚰IHi穗化 . 按硝酸纤 维素膜离心法回收【 . 取古插入物 的液体