PDF《满林丁建》

8 0 和 古载 体的 液体

2 o I 匣合 , 加 乙醇沉 淀后 . 藩于7.5双蒸水 中, 补加l0m mo l / LAT P1 L . T | D NA连接 酵 2单位 , 反应体 积1O.于16℃ 过夜 .转化E. c o b D I - L S a后. 涂 于古 ^mp的LB平扳 上.从u平扳上撬取 单十 蔼落 , 小量法 抽提 质粒 , 初步 检嗣 雨性 重组子 . 连一 步 甩爵切 分析 鉴定.4I组质粒 的一 切分 斩与 P CR扩 增鉴 定 分别 甩EcoRi/ B a mHi、 E c o Ri/ s I、 P a t i、 s 阻I、 X h oi和S*li酵 切重 组质粒, 根据酵切结 果.确定重组 质粒 中外 瓤基 因插 入与 否盈 分析酵 切位 点的 分 布情 况 .重 组质粒作线 性化处理 后 为摸 扳.按上述 P R V 基因 组DN A作 筷扳 扩增 P K基因 相河 条件 和方 法. 进行PCR, 然 后取扩 增物 作 电辣 分析 . 结果1PCR扩增产物的分析PRV基 因组 G+ c古量特别高, 这给 P C R扩增带 来很大 困难 .在常规条 件下扩 增, 未能 从PRV基 因组模板 中获得任何相应产物 .作者 在扩增反应藏 中加入 甲酰胺 、 甘油或 DMS O, 结果在 补加

1 0% DMS O时扩增 , 可得封预定大小的产物( 见图 l a ) ;

将第 一次扩增 产物 中预定 大小条带 回收后作模板进行再次扩增, 也能 从扩增 物中得 科预 定大小的条带 ( 见图 l c ) .

2 P C R扩增 产物 的克 I 薹和组 螽垃的鉴 定 按图 2所示 PK基因克隆的策略 , P C R扩增产物 以E∞RI/ Bm I消 化后, 与相 同双酶 切的 p UC

1 9载体连接 , 转化E. c o / i DHS a . 在Amp的LB平板 上获得 多个 苗落, 挑取 了10余 个菌落扩增 , 抽提质粒, 经分子大 小比较, 其中 3个 明显 大于载体 , 初 步确 定为 阳性 重组 子, 当用EcoRI / B a m HI双酶切后, 可见从中切出大小为

1 . 3k b的一个 片段, 这 即为所 克隆 的外 源基因( 见图 l b ) , 此重组质粒命名为 D P K;

为了进一步验证这个基因 克隆的可靠性 , 以此 p P K为 模板进行 P C R扩增, 仍能 从扩增样 品中得到预定大 小的产物( 见图1c),用限制性 内切 酶消 化pPK, . 证实在所克隆 的PK基 因中 P s t I、 S maI、 Xh oI和saII各 1个切点 ( 见图

3 ) .酶切 位 点分布与 已发表 的PRVNI A一3株PK基 因酶谱 图相符( 见图

4 ) , 由此证 明我 国PRV地 方株 P K基 因与 NI A一3株PK基因具有很高 同源性 . 讨论在PCR扩增 产物 的分析 中, 作者发现扩增 产物中除了预定大小的条带外还发现 另- -/ b分 子量的条 带, 可能 为引物 =聚体 , 当它较多时则严重干扰 P C R扩增效果 .由于我 们 其是 应甩 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第11卷一一翻1PRVPK基 因的 P C R扩增 和基周 回切 a . 病毒基 周组 D N A为模 板. F C R扩增产 物, 萁中1为标 准分子 量参黑 物, 片臣 大 小为 :

1 5

4 3 b p .

9 9

4 b

6 9

5 b p .

5 1 5b p ,

3 7

7 b p .

2 3 7b p;

2―3为PCR扩 增产 物_b重组 质粒 p P K 摹周 回切 ;

1 . VHi I - dⅢ.

2 p P K / E c o R I ― E e mHI.

3 . p P K / E c o RI.

4 p ~1

9 / E c o RI;

C 不 同模 板的PCR扩 增产物, 1标准DNA分 子量参照物 ( 片瞪大小 同围 a )

2 . P R V D N A 为模 板3.回收的扩 增产物 为摸板

4 . p P K 为筷 板. Fn g l Th e a m p l i l '

ma t / o n P RV pr o t e h ~ ki r ~ e g q me b7 P CR 姐di t s r e e x c i s i o. a . P C R p 士odtIct5wi t h v i r a l g e n o meDN A 罄rn出.1:M a r k e ro f s t a n d a r d DNA mo l e c u l a r~ i g h t .t h ef r a g 咖bare1