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第 7卷 第 1期 l g g 睥 s月 中国囊毒学VI ROLOG I CA SI N I CA D / .

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1 g0 油桐 尺蠖 核多角体病 毒 多角体 蛋 白基 因定位 与克 隆* 刘明富 胡 志红 金锋李孟津 谢 天恩 帅酣端姐椭肫勰 5・3提要以L ¨P ~ - d ATP标记含Ac NP V DNA 的EcoRI ― I 片段的重 组质 粒 为探 针,在3

5 X

2 条 件下 对油桐尺 缝楮多角体 满毒【B s NP V )多角体 蛋 白基 阻进 行 了定 位 ,将 其分别定位在 Ba m H I-A, Bg lI - A , Bg lⅡ - F, Ec o R I― R , H i ndⅢ -A, Kpn I― I , P s tI― D , Xb aI ― A ( 或B),Xh oI - F和 G片 段上 , 并以M1

3 mp t

8 为载体克隆了 Kp nI―I 片段.油因分子杂交同源 性口Nuc l e a r Pc] y hed r os i s Vi r us . B s NP V) 于1978年在 我国被分 离, 到 目前为止仍仅 存在于我 国. 对这种病毒 已进行了 广泛的研究, 包括 理化特性,形态结构与发 生 ,体 外感染特性,安全性评估及用于生 防的潜力 ).为了进 一步研究其分子生物学特性, 开发 我 国这 种特有的病 毒 资源 成为体外表达 系统, 在前 文研 究其核酸性质的 基础 上, 我们以苜 蓿银纹 夜蛾核多角 体病毒 (Ac NP V)多角体 蛋白基 因作探针 , 对BsNP V湖北羊楼 洞株进行 了基 因定位及 克隆, 结果 报道 如下.材料与方法

一、BsNPVDNA摄取 多角体由本 所 昆虫 满 毒室 提供 . DNA 提取过程参 见 文献 (

3 ] . DNA 分装于TE(p H7 . 6)中=、D NA 一切与电津 本实验所 用限制酶 及酶切缓冲液 均购自华 美生 物工程公司(SAB C ) 酶切与电泳 方 法参 见文 献(3]

三、D NA S o u t h e r n吸印硝酸 纤维素膜 (

0 .

4 m)为S&

S产品.DNA S o u t h e r n吸 印按 s a m b r o o k 【 ・

1 介绍的方 法吸 印2

0 h r ,在普通烘箱中7

0 ℃固定3hrI;

I

四、探针爿鲁与分 子杂交Ac NP V DNA E c o R I ―I片段(台 多 角体 蛋 自基 因 )的 重 组质 本文子

1 9

9 1 年 4月2 T日收到 .1 a 月21日修 回 国家 自然科 学 基盘挠 助 谭题 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期刘9月富等 :油桐R蠖核多角件 病毒多 角体 蛋 白基因的定 位 与克 隆粒由武 汉大学叶林 枷赠送.[¨P]一aA~ P (

3 0

0 0 C i , mm o

1 )及Ni c k l '

r

4 Ⅱ s l a t i o I I Ki t 均购自北京 福瑞公司.探 针制各按 试剂盘说昵书进行 . 标记的DNA 通过Seph~clexG一

5 0 桂 层析 分离.严格条件杂交(68℃)按 文献 [

4 ] 方法.非严格条 件杂 交(3

5 ℃ ) 按t[o~ley及 S mi t l l等方法1¨¨,甲酰胺 浓 度为

2 0 ―

5 0 瞄.杂交时间 约3

0 h r .

五、D NA克隆及鉴 定克隆载体 为M1

3 r ap1

8 , 宿主菌为JM1

0 5 . 烈低溶点琼脂糖回收BsNP V DNA Kp n I―I 片段(即 B s NP V多角 体蛋 白基 因所 在片 段)按文献[4]方法克隆 . 以含 Xg a l的平 板 初步 筛选阳性重组子,扩增 后 咀此 为探针与I~sNP V DNA各种酶解 产物在上述6

8 ℃条件下杂 交 ,进 一步确定阳性 重组子. 结果

一、BsNP V D NA酶切与电泳 B s NP V基 因组总分子量约

1 2

9 k b ,常 用的几种限制酶 图谱 见圈 l.各片段的大小在 文献[

3 ] 中已有报道. 图1B8NP V DNA限 制酶酶 切图谱,

0 . T 嘶琼脂糖FgI.Re日 l r 【 c t i O D m p

0 f I t sNPV DN^( O .

7 啊Ug日r0se)K.Kpn I ;

B. B^m HIi B I , BgII ;

B Ⅱ , Bg lⅡ ;

E, E c 0R I ;

H , Hi ndⅢ ;

P, P§ tI ;

Xb, Xh日I ;

Xb, XhoI . 圈2[{2Pj―dATP标记 的含 Ac NP V DNA Ee o RI―I 的重 组质 柱与I l s HP V 各种限制 酶酶切 产物 的杂交 图谱. 阳性对 照,EeoRI酶切曲Ac NP V DHA E . RI I重组质 柱(放射自显 影1