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1 t ybr l d i z 日I i o p r o f i l e o f I t ~ NP~ DNA dl g e ~ t e d bY … t r l e t i v … … Y 日Ae H PV DNA Ec o R I 一1 r e m b1 t pl a ~ m i d o f 日P.be,uI :

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2 O % f… amj de 日t35 ℃ .Co nt r ol , pI I R

3 2 ~ pl a s h e d o f Ae N I ~ ~ E e oR! 一1dige s t ed b, I ~ ~ o l t I ( e x p o ~ e d r

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1 0 b r ) ¨ 孵疆维普资讯 http://www.cqvip.com 中目期毒学第7巷

二、分 子杂交用Ac NP V DN A E c o RI ― I 作探针在68℃下 多次杂交都未发现任何可见杂交带 (结果未列入 ).但在3

5 ℃,2

0 %甲酰胺 条件下杂 交, 放射 自显影

1 0 h r就可见 到清晰的杂 交带(凋

2 ) . 当甲酰胺浓度分 别 升至3

0 、

4 0 %及5

0 时, 杂 交带强度逐 渐减弱.

4 O %时 各种 酶基本上呈单~杂交带, 只有 X b o I 有二 条. 它们分 别是 B a mHl ― B (

2 7.

5 kb ) , B g l I ― A (2 9.

5 k b), Bg l Ⅱ - F (4.

7 k b ), Ec o R I― P(2 .

5 k b ), Hi n dⅢ一A(3

2 .

5 k b), K p n I ― I (2 .

0 k b), Ps t ― D (8 .

0 k b), Xb a I ― A 或B , Xh o I ― F和G (9 .

5 k b 和6.5kb,见图3) .

5 0 甲酰胺的杂 交结 果与

6 8 ℃一样,亦来发现杂交带 (结 果未 列入). M

1 3m p

8 图3At PV DNA E e o RI―I为探 针与 BB NP V D N A 各种酶 酶切产 物 的杂交

3 5 ℃ ,4 o 嘧甲 蘸胺).箭头表 示B$1I有一 条 杂交带, x - . I 有两 条杂 交带. 阳性对 照 同图 2, 但来 用限制 酶酶切 . Fi g

3 Hy b r i di t a t l on p r o f i l e o f Bs N PV DN A t l ude r l -㈨ Ⅱt i l t i 0n o f

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0 f Ae NPV E o Rl ― I ・ j h,b r l d i z ~d c o nt r o

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2 b y b r i d l t a t i o a b a D d B ( B r r o

5 ) i Ⅱ t b . s l o t B

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Dd x b .I , . pe ~ t i ve l ,. 图4BBNp V DN^ Kp .I―I为 探针 与B } NP V D N A 各种酶 切产 物 杂交 r

6 8 ℃ ) .箭 头表 示Bs I Ⅱ有 两条 杂交带 . F i g

4 . Hyb r i di z at i o n p r o fi le o f B日NPV DNA . Tbe … ombj … l D f M

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8 D d Bs ― NP V Kp I―I( Re c )B 日P.be.TobaDds 0w)LnB^lⅡsl¨【.

三、克隆及鉴定从Xg a l 平板上 随机 挑选 ~ 自斑, 扩 增后 提取 其双链 DNA .Kp a I 切割后产生二 条带,较大带 为载体 D NA(Ml ,

3 mp l 8), 较小带与 B s NP V DN A Kp n I ― I 泳动 速率一 致 维普资讯 http://www.cqvip.com 圭第l霸剂明富等:油桐尺蠖核多角体病毒多角体蛋白基困的定位与克隆

8 3 以此重组 DNA为 探针,

6 8 ℃条件下与 B s NP V D NA各种酶切产 物杂 交, 其结 果与4 O 甲酰胺条件下杂 交 结果基本一 致,只是 B g I Ⅱ 多出了一 条杂 交带 (D片段,6 .

5 k b), 表明Kp n I ― I 片段 已被克隆 (见图4). 讨论昆虫杆状病毒多 角体 蛋 白基因 具十分强大的 启动 子, 以此构建 表达 载体生产重要的 医用 蛋 白等物质具 有广阔的 前景, 这方面 的工作尤以 Ac NP V和家 蚕核 多 角体病毒 ( BmNP V) 进 行得较为 出色 】 . 多角体 蛋 白基 因在 进化上是十分 保守的, 据此, 以A e NP V 多 角体蛋 白基因为标准, 多种病毒 包涵体蛋 白基 因被 定位.美州棉铃虫(He l i o t h i s z e 口)S NP V, 梨豆夜蛾(An l i c a r s a g e mma t a l i s)MN PV ,棉铃虫(He g i o t h i s d r ― mi g e ~ a)NP V 及粉纹夜蛾(Tr i e h o p l u s i a h i ) GV DNA 即使 在60甲酰胺 条件下也能与AcNP V DN A E c o RI ― I间形 成稳定杂交体 , 表明其包涵体 蛋 白基 因同源佳不低于85,而斜 纹夜蛾为