PDF《for Waxy protein》

293 份,其中荷兰小麦、合成

33、内乡白火麦 (b)

3 、江苏白火麦、关东

107、IKE、Stur2 dy、Satanta、糯麦一号、糯麦二号等材料由中国农业大学姚大年、刘广田惠赠 ;

中国春缺体 ― 四体系引 自美国堪萨斯州立大学小麦遗传资源研究中心 ;

其他材料由南京农业大学细胞遗传所提供.扬158/ 糯 麦一号 , 扬158/ 糯麦二号 , 扬158/ 荷兰小麦 , 扬158/ 关东

107 , 荷兰小麦/ 扬962152 , 荷兰小麦/ 内乡白 火麦 (a) , Eradu/ 内乡白火麦 (a) 等组合的杂种 F1由作者配置种植.

112 方法

11211 Waxy 蛋白提取和 SDS2PAGE 电泳 参照王子宁等的方法[13] , 略有改动.将淀粉提取后 , 用含

5 % SDS 的提取缓冲液在沸水浴中加热提取 3~5 min , 趁热离心 (10

000 r・ min -

1 )

5 min , 弃沉淀 ;

上清 加入

1 mL 丙酮 ,

4 ℃ 沉淀

1 h 后,10

000 r・ min -

1 离心

5 min , 弃上清 ;

沉淀在室温干燥 ,

4 ℃ 保存备用 , 或加入 40μ L 上样缓冲液 , 在沸水浴中加热

5 min , 冷却至室温 , 电泳.

11212 基因组 DNA 的提取 种子发芽后 , 室温生长两周左右.叶片黑暗培养

2 d , 在液氮中研磨 , 用SDS 法提取 DNA[14] .杂种 F1 植株温室盆播后按单株提取 DNA.

11213 Wx2A1 基因位点上 STS 标记 左端引物 : 5′ 2TTGCTGCAGGTAGCCACACCCTG 23′ [15] ;

右端引物 : 5′ 2G ATCCAGCCAGTCAGTAAAG 23′ , 作者根据文献 [15 , 16] 测定的基因序列自行设计. PCR 反应体系 : 25μ L 中含

1 倍buffer (10 mmol・ L -

1 Tris2HCl ,

50 mmol・ L -

1 KCl ,

115 mmol・ L -

1 Mg2 Cl2 , pH 810) , dNTP 800μ mol・ L -

1 , 引物

014 mmol・ L -

1 , 模板 DNA

60 *

10 -

9 ~100 *

10 -

9 g , Taq DNA 聚 合酶

1 U.PCR 反应条件 :

95 ℃5 min ;

94 ℃50 s ,

55 ℃60 s ,

72 ℃80 s ,

35 个循环 ;

72 ℃10 min ,

10 ℃ 保存.电泳检测 : 扩增产物中加入

6 倍加样缓冲液 5μ L (0125 %溴酚蓝 ,

0125 %二甲苯青 ,

50 %甘油) , 在8%非变性连续聚丙烯酰胺胶 (Acr∶ bis = 39∶ 1) 上电泳分离 , 缓冲体系为

1 倍TBE , 恒压 130~150 V , 电泳 2~215 h , EB 染色后 , 紫外灯下检测 , 照相.

11214 Wx2B1 位点的 STS 标记[

3 ,

4 ,

10 ] 左端引物 : 5′ 2AACCAGCAGCGCTTCAGCCT 23′ , 右端引物 : 5′

2 TTG AGCTGCGCG AAGTGCTG 23′ .扩增与检测方法参照梁荣奇等[3] 的方法.

11215 Wx2A1 , Wx2D1 位点的 SSR 标记[

4 ,

11 ] 左端引物 : 5′ 2CGCTCCCTG AAG AG AG AAAG AA23′ , 右端引 物:5′ 2ATAGGCACAACCCCTAAC23′ .扩增按梁荣奇等[4] 的方法 , 检测用

8 %非变性连续聚丙烯酰胺胶 (Acr∶ bis = 19∶

1 或39∶ 1) .

2 结果与分析

211 小麦品种 Waxy 蛋白亚基 SDS2PAGE 的鉴定 用王子宁等[13] 的SDS2PAGE 方法对已知分别缺失 Wx2A

1、Wx2B1 和Wx2D1 以及同时缺失 Wx2A1 和Wx2B1 亚基材料做预备实验 (图1A) .已知缺失 Wx2A1 的荷兰小麦和 Sturdy 缺失最上面的 HMW 亚基 ;

缺失 Wx2B1 的Eradu 缺失最下面的 LMW 亚基 ;

缺失 Wx2D1 的江苏白火麦和内乡白火麦 (a) 缺失中间 LMW 亚基 ;

同时缺失 Wx2A1 和Wx2B1 亚基的关东

107 缺失 HMW 亚基和最下面的 LMW 亚基 , 均与姚大 年等[6 ,7] 研究结果一致.而内乡白火麦 (b) 和Satanta 缺失 Wx2A1 和Wx2B1 , IKE 和合成

33 没有缺失 , 与姚大年等报道[6] 内乡白火麦 (b) 和合成

33 缺失 Wx2D1 , Satanta 缺失 Wx2B1 , IKE 缺失 Wx2A1 和Wx2 B1 的结果不一致 , 其原因有待进一步分析. 利用 SDS2PAGE 方法 , 检测了