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第1

2 眷第3 期1999'年9月 中国病毒学VI ROLOG1 C A S l N1 CA 知给》)vd .

1 2 No .

3 S印.1997A从重症肝炎病人血清分离的丁型肝炎病毒 核酶 区的克隆与序列分析 ' 李如琳 万泽 生 徐德 忠'(第四军 医大学藏行病教研 室, 西安710032)(军事 医学科学院徽 生物菹行 病研究所. 戈京 t

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0 7

1 ) ( 第三军 医大学徽 生物教研 室, 重庆

6 螂】R7'2} R i

2 、 o 提要从我国一捌四川丁型肝炎病毒I I D V R N A . 丁蛩肝夯^巨均阳性的重症肝麦患者的请 毒、拟病毒有许多相似之处. 丁肝感染常与 乙型肝炎病毒重叠感 染( p e r i 玎fe∞) 或共 I 感染 ( c o t n f e c t ~ m) , 并与暴发性肝炎, 重症肝炎. 及肝硬化密切相关【 ' 一'.】.另―方面对 H D V R N A的一些特殊功能, 如核酶 ( R i b o z y me ) , 编辑 ( E d i t i n g ) 的研究, 不仅有劲于全面理解 H DV 的复崩 机制 , 而 且为人工设计核酶来预 防、 治疗 HD V 及其它致病 因子 的感 染提 供 了某些可能的线 索.我们用 R T―P C R法^L一重症肝炎病 人血清 中克隆了 HDV R NA核酶 区基因, 并进行 了序列分析 . 材料和 方法 l 标本来 覃 一男性病人 ,

5 8岁, 诊断 为慢性 重症肝 炎.}硼(+) , | 玎k^ 窖(+> . } 玎衄^g(+) , 抗一HDI g M( +) . 抗一HA Vl g M(+, . H DV P . N^( +) .

2 主要 试捌 逆转录酶 A MV, R Na ~ n . 各种 内切酶和 T 4DN A连 接酶赡 自岫Ega公司, Ta q酶 及其 B l 购自 京毒公司, X ― C r a l , I P T G 购自P i o m e g a 公司. 载体P C R T M I

1 及M1_分崭购自l n v i u r o g ~公司 及华 美生 物公 司. DN A 序试 荆宣 购自USB公 司3引曲 抗基因组 序刊为5一5一美云、刘善虑 研究 员赢赠 一3'c941nl一9

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1 ) . 基 因组 序列 为3'(651nt~6

7 2 n t ) , 由 中国璜防 医学 科学 豌病 毒 学研 究所 肝炎 室詹 牧 薯日 翻:

1 9

9 6 一1

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2 7 , 謦目日期:

1 9

9 7 ―

9 3 ―

1 0 此工作在军 事医学科 学院羹 生协藏行病 所完虞 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第12卷

4 H DV RN A提取、逆转豪 和PCR扩增 取HDA g 、 I - I DV DN A均阳性血 清200L参 照文靛 _

1 ¨的方法 , 提取I-IDVRNA ' 随后加 入随机 引物, 在1O反应体 积中( 含5xR T b u f f e r

4 L , R Ns i n

4 0 u ,

1 0 mmo l / L d N TP

2 , . R a n d o m P t J f f R ~ r

2 L , S u p e r s ~i p t I

1 1

0 u )

5 O℃1 h , 取10逆转录产物 , 在5O反应体积 中( 含10XP C R b u f f e r

5 v L,

1 0mmd/ L d N T P1 L . 引物 各为1.94℃ 1r a i n ,

5 5 ℃ 1r ai n ,

7 2℃

1 mi n

3 0∞亡.40循环 , 第一 轮循环前 璜变性 7r a i n . 循 环结 束时,

7 2℃ 延伸

1 Omi n .

5 P C R产 物的克 睦PCR产物用 电诛洗脱法 回收后. 直接 与PCRTMI1载体进 行 连接 , 连接 体积 为lO止 . 取 1止 转化INV= F " 感受 态细 瞻, 利用 X―G a

1 . I P T G拽选 白色 苗落 , 碱裂 解法提 取 质粒 , 用EcoRI进行 酶切鉴 定.拽出阳性 克隆.

6 按苷酸 序捌 分折 大量 提取阳性 克隆的质粒 后用 E c o RI切 下的插 入 片殷插 入M| ] 呻.

9 的EcoRI位点, 挑选白色噬斑 , 提 取单链 , 采取 双脱氧链 终止法测 序. 结果1PCR产物 殛阳性克隆的鉴定 从PCR产物

5 O L中取

5 L在1%的琼脂糖凝胶电泳, 可 见一条约

2 9 0b p的DNA条带. 从20个 白色菌落 中提取质粒做 E c o R I酶切鉴定, 获得 8个阳性克隆, 隧旨经 P C R进行验证 , 均含 有插入片段 .