PDF《R 基因家族克隆及》

8 ] . 然而,关于青蒿 HMG R 家族研究未见报道,各家族成员在 青蒿素生物合成中的具体贡献也不清楚. 本研究以青蒿为研究对象,根据我们和上海交通大学联合测定的青蒿全基因组序列( 未公开) ,结合 R A C E 技术克隆青蒿 HMG R 家族基因,并对其进行了生物信息学分析. 通过实时荧光定量P C R 技术,对3 条HMG R 基因进行了组织表达特异性分析,以及 M e J A 和损伤诱导的表达模式分析. 通过不同层面的实 验数据以及分析,解析青蒿 HMG R 家族成员不同功能.

1 材料与方法

1 .

1 植物材料以及处理 材料为具有相同遗传背景青蒿快繁幼苗( X i a n ge t a l ) [

1 0] . 参照 W a n g等[

1 2] 和Liu等[

1 3 ] 的方法进行 M e - J A 和损伤处理. 将实验材料用液氮研磨,提取 R NA 后反转录合成c D NA 用于后续实验,提取 R NA 和反 转录方法参考 L i u [

1 3 ] 等的方法.

1 .

2 基因克隆 根据青蒿全基因组、 t r i c h OME D a t a b a s e 、N C B I上已经报道的青蒿 HMG R 基因片段,利用 V e c t o r NT I s u i t e

1 1 . 5软件进行拼接与比对找到3条不同的青蒿 HMG R 序列,根据这3条序列分别设计3 ? R A C E 巢式 P C R 引物( 表1 ) ,利用引物、 d NT P和HiFi酶等按巢式 P C R 程序扩增获得 A a HMG R s 的3 ? R A C E, 利用拼接结果设计5 ? R A C E巢式P C R 引物( 表1 ) ,按照同样程序获得A a HMG R s 的5 ? R A C E,并拼接获得 A a HMG R s 的电子全长,用PCR扩增获得 A a HMG R s 的物理全长. 表1 基因克隆相关引物 引物名称 类型 引物序列 (

5 ? -

3 ? ) HMG R

1 -

3 3 ? - R A C E

1 - A C T G G T G A T AA T GA T GA T G G T A

2 - A C A GA T C AA G C A G AG A C A T G T C HMG R

2 -

3 3 ? - R A C E

1 - C A G T C A C C A T G C C T T C AA T C

2 - C AA C TA C T T C T G T T C C T C T C C HMG R

3 -

3 3 ? - R A C E

1 - TA G A T T G T G AG T C A G A T G T G G T C

2 - T C T T GA T G G T T T G C C T C T AG A G HMG R

1 -

5 5 ? - R A C E

1 - GA T C T T G T C G C G C C A T C T G T G A

2 - G TAA T G G T AA T G C G T C T GA G G C T HMG R

2 -

5 5 ? - R A C E

1 - C G AG T T T C G C C A T T C A T G GA T G T

2 - C G A G T T T C G C C A T T C A T G GA T G T HMG R

3 -

5 5 ? - R A C E

1 - C C AA G C T T G GA T T C C AA C G A G T

2 - C C A C AA GA G C T C A C A C G A C T G T M

1 3

3 ? - R A C E G T T T T C C C AG T C A C G A C U PM / NU P

5 ? - R A C E U - C TAA TA C GA C T C A C T A T A G G G C N - AA G C A G T G G TA T C AA C G C A GA G

1 .

3 生物信息学分析 通过 V e c t o rNT I s u i t e

1 1 . 5软件进行C D S的查找和翻译,在NCBI网站的B L A S T 进行核酸和氨基酸 序列比对;

用ClustalX软件进行氨基酸序列多重比对,用ME GA

4 . 1的Neighbor-joining进行进化树的构 建. 蛋白质的基本性质在 E x P A S y网站在线分析.

1 .

4 表达分析 根据获得的A a HMG R s利用B e a c o nd e s i g n e r软件设计荧光定量特异性引物( 表2 ) , E F

1 α为内参基因,用 染料i T a q TM U n i v e r s a l S Y B R? G r e e nS u p e r m i x通过i Q

5 c y c l e r荧光定量P C R仪反应并根据2 -Δ Δ C t 方法计算得到 A a HMG R s的相对表达量,反应的条件为:预熔解9 5℃2m i n ,熔解9 5℃1 5s ,退火5

8 . 2℃2 0s ,

7 2℃延伸

2 0s ,循环4 0次,熔解曲线,

5 5 ~

9 5℃,

8 0个循环,每循环升温0 . 5℃( L i ue t a l ) . 表2 基因表达分析引物 引物名称 引物序列 (