PDF《维普资讯 http://www.cqvip.com》

7 f

6 第1

0 卷第4 期l995年12月中国病毒学V吸0L

0 GI CA 缸NICA77幻) V0 I _

10 N o.

4 De c.

1 9

95 和A编码人疱疹病毒一

6 型核糖核苷酸还原酶 和P4I蛋白基因的克隆和序列测定 钱利生--I 一(上海 医科大 学擞 生镑 学教 研组 , 上海

2 0

0 0

3 2 ) 山西 弘一一(日本大 阪大学 医学部 微生物学 教室.日奉 ) 提要 本文报道人疱疹病毒一

6 型( HH V .

6 ) p S T y F .

8 D I N A 片段的序列测 定. 应用分子克隆、 缺损突 变体( D e I e t _ 帕nmutant)制备和序列测定等技术 , 完成了3 J

9 k b H I - I V ・

6 p S T Y2

8 D I N A 片段的全序列 , 测定.经DNAS I S核酸蛋白软 件 分析 . 该 片段 含 有两 个开 读 框架 ( ORF) 核糖核苷 酸还 原酶 Ot l R) OR F有2414个核 苷酸 . 可编 码805个氨基 酸;

P41蛋白由I

1 0

0 个核 昔酸 组成.与其 他疱 疹病 毒作 氨基 酸同源性 比较 . HHV.

6 R i R 与人巨细胞 病毒(FICMV)有 高度 同源性 , 最适 记分(Op t i mi z e d s o o r c ) 微结构研 究显示 , HHV一6颗粒 约为2

0 0 n m 大小伴 有包 膜的病毒 , 具有 l

6 2 个子 粒组成的立体对 种核 衣壳. Ma r t i n等报道 [

3 ] HHV一6为dsDNA. 长约

1 7

0 k b . 部分 D NA序列分析显示 . 该病毒与 人巨细 胞病 毒(HC MV) 密切 相关. 本研 究应甩缺损 突变 体,对编码 HHV.

6 核糖 核苷酸还 原酶 ( R i R) 和Pd l 蛋白的 D NA作 序列测定 , 并用 D NAS I S系统对 该段基 因与其他疱疹病毒 作同源 性分析.材料与方 法IHH V・ 6D NA 基 崮库 的组 建HHV一6HS T 株(日本株 ) D NA 用PstI内切 酶消 化,与载 体pUCI

9 连 结后 转化 大肠扦菌 ( E . ) j Ml ∞株,用同位素标记 的HHV.6DNA探针筛 选DbIA一 质粒重组 俸.获是 系列 D NA克隆i]o选择pSTY2

8 一 克隆 作DI N A 序列测 定'

.2tits突壹体的制备

3 0 B H HV ・

0 p S Ty

2 8 D NA 一 质粒重组体 , 经桩酸外切酶 Ⅱ消化, 用绿豆芽( Mu n g b e a n ) 核酸酶( 购自日本 N i p p o n g e n e株式社 ) 切I形成千头束端 . 通过 T4 D NA连接酶( 由日本 T a k a r a 株式社 提供) 连接 I f i - 转化 E. 邮I t J M

1 0

9 , 用搠 旨糖电泳筛选 , 按DNA 电泳位 置 获得 系列缺 损突 变体 , 根据 DNA 片段 的互相暂接 , 选择缺损突变体 B

7 、 D

3 B 等共

1 3 株菌株 , 采用 裂解法[ 提取缺损突变体 D NA用作序列测定. 4: 文于199啤1甘9 H收到 ,

4 . q

2 0 日修回*存日奉大驻大学进修基期固进行谖项 目 研兜 维普资讯 http://www.cqvip.com 3】

0 中国病毒学第l0卷

3 聚合酶链反应( P C R) E 对未能用缺损突变体连接 的D NA区段 , 根据巳测出的棱酸序列 ・ 设计2 段寡棱苷 酸作 为 引物 , 以HHV一6DNA 为模 板,用PCR扩 增后 作DNA序列测定 . d D N A序列测定 用双脱氧链末端法0 ] . 缺 损突变体 D N A经荧光染料标记 的弓 I 物延伸( 测序试剂盒 由日本Ap pl i e d B i o s y a t e ms公 司提供 ) , 用3

7 3 A DNA 测 序系 统(AB I系统 , 日本 ) 作DNA序列测定 . 荧光 染料 标记的引物 序列 与pUC1

9 端序列一 致.该引物序 列为 ~TG TAAAAC GACG C r C C AGT

3 f . s 核 酸序 列 的计 算机 分析使用 H i t a c h i 公 司的 棱酸蛋 白分 析软件 D NAS I S 系统 , 在raM- P C微机 上进 行测 序结 果分 析,并与其 他疱 疹病 毒作 同源性 比较 . 结果】缺损突变体和特异性PCR引物 . 为作 DNA 序列测 定,用外切酶 Ⅲ消化 的pSTY2