PDF《Biacore 检测法与免疫沉淀法的比较：》

应用实例 Biacore Biacore 检测法与免疫沉淀法的比较: 迅速而且非破坏性的蛋白质复合体的检测 前言 作为一种检测细胞内蛋白质相互作用的方法,免疫沉淀法得到广泛应用.

使用Biacore系统,可以进行与免疫沉淀法相同的试验.通过免疫沉淀法,构成复 合体的蛋白质,能够使用SDS-PAGE或免疫印迹方法加以确认.另一方面,通过 Biacore系统,能够迅速而且非破坏性地检测出复合体.由於能够通过微量样本 就能取得结果,对於提高实验的效率很有帮助.本文对分别使用免疫沉淀法和使 用Biacore系统来进行蛋白质复合体检测的项目进行了比较. Biacore 法的特点 ?1 次测定时间约

5 分钟,即时确认各过程的相互作用 ?通过与参照物同时比较,很容易判断特异性结合 ?也可以检测出低亲和的相互作用(可以检测出快速解离的反应) ?也可以检测出复合体的动力学和亲和力特性 ?通过晶片表面技术,可以与品质分析等其它方法进行组合 应用实例 Biacore 通过 Biacore 系统检测出蛋白质复合体 为了执行免疫沉淀法,需要确认足量的样本,并且为了能够抑制非特异的结 合,有必要探讨条件的优化或基於亲和力的洗脱条件.从实验开始到进行判断为 止,至少需要 1-2 天的时间,繁杂的过程以及讨论条件所需要花费的时间已经成 为这种方法的瓶颈.现在,人们期望能够消除这样的"繁琐",提出迅速而 且灵敏度更高的检测方法. 使用 Biacore 系统,可以进行与 免疫沉淀法相同的测定.在固定 特异性抗体的感测器表面上,添 加细胞萃取液,将蛋白质复合体 捕捉到感测器表面,我们能够即 时地观察结合的情况.关於捕捉 的复合体,通过进一步按顺序添 加抗体等特异性结合分子,则能 够识别复合体的构成蛋白质.

1 次相互作用的测定时间大约为

3 ~

5 分钟,使用微量的样本 就能够获得结果.能够迅速地发 现优化条件,有助於提高实验的 效率. 图1复合体构成蛋白质的识别 实验(实验过程如右上图所示) 在固定对应於蛋白质 A 的抗体的感测器晶片上,添加细胞萃取液. ① 基线:关於固定抗蛋白质 A 的抗体的感测器表面,将感测器表面的信号作为 基线. ②添加细胞萃取液:通过参照物同时显示的功能,只显示特异性结合信号.能 够即时地确认复合体 AB 的结合.样本添加时间:2 分钟 ③添加抗体:通过添加抗蛋白质 B 的抗体,检测出与 B 的结合(实线) .添加对 照组抗体时,没有看到讯号上的变化(虚线) .添加时间:2 分钟 ④再生:通过添加再生液 (10 mM Glycine-HCl, pH2.0) ,洗脱复合体,返回基线. 再生后的感测器表面可以进行反覆测定.添加时间

30 秒. 通过 Biacore 系统进行蛋白质复合体检测的实例 存活运动神经元蛋白质和 p53 之间的直接相互作用以及与脊髓性肌萎缩的关系 P. J. Young, P. M. Day, J. Zhou, E. J. Androphy, G. E. Morris and C. L. Lorson J Biol Chem 277: 2852-9 (2002)