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华中农业大学 生物质与生物能源研究中心 实验操作手册

2018 年6月制 编者名单 主编:黄江锋 李丰成 编委:范春芬 李英胡慧贞 李傲孙丹汪洋胡振徐成宝 王金彤 张冉张贵粉 朱晓博 吴雷明 杨巧梅 刘鹏靳晓焕 李先良 吕政熠 责编:王艳婷 涂媛苑

2018 年6月第

1 次编印 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 目录分子克隆

1 DNA 提取.

1 RNA 提取.2 基因表达分析.5 载体构建(常规)6 Gateway 系列载体构建

12 单位点 CRISPR 载体构建.13 多位点 CRISPR 载体构建.15 农杆菌操作.18 转基因操作

20 水稻转基因.20 拟南芥转基因.23 洋葱表皮细胞瞬时转化.23 分子标记

25 蛋白、生化分析

27 蛋白质原核表达.27 抗体制备与纯化.28 Brandford 法测定蛋白浓度.29 膜蛋白提取与分离.30 免疫共沉淀(CO-IP)30 SDS-PAGE.31 Western blot

32 纤维素体外合成.33 纤维素酶活性测定.34 β-葡萄糖苷水解酶活性测定

35 酵母双杂交.35 染色质免疫共沉淀(ChIP)38 细胞学实验

42 I 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 琼脂糖包埋震动切片.42 石蜡包埋半薄切片.42 树脂包埋超薄切片.43 叶片细胞形态学观察.43 纤维素染色观察.44 木质素染色观察.44 多糖抗体免疫荧光观察.44 多糖量子点免疫荧光观察.45 拟南芥种子果胶质免疫荧光观察.46 胼胝质测定与观察.46 GUS 染色观察.47 水稻原生质体分离与激光共聚焦观察.47 扫描电镜观察.48 透射电镜观察.49 原子力显微镜观察.49 水稻农艺性状分析

51 机械力学性状考察.51 水稻考种.51 稻米品质测定.52 淀粉含量测定.53 光合速率测定.55 稻瘟病抗性分析.55 白叶枯病抗性鉴定.56 褐飞虱抗性鉴定.56 植物细胞壁成分分析

58 细胞壁多糖提取.58 比色法测戊糖、己糖和糖醛酸.60 硅含量测定.61 提取粗纤维素.62 II 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 纤维素聚合度测定.62 纤维素还原端分析.64 纤维素结晶度测定.64 木质素总量测定.64 木质素单体分析.65 键连接分析.67 乙酰化分析单糖含量.67 硅烷化分析.69 甲基化分析.70 2-AB 衍生化分析.70 GCMS 测定可溶性糖

71 生物质降解效率分析

72 碱预处理及酶解.72 酸预处理及酶解.72 液体热水预处理及酶解.73 CaO 预处理及酶解

74 蒸汽爆破预处理.74 表面活性剂的添加及酶解.74 生物质发酵产乙醇分析

76 乙醇发酵.76 乙醇含量测定.76 细胞壁孔径分析

78 Simons'

Stains 方法测定孔隙度.78 刚果红染色测定纤维素孔隙度.79 纤维素酶吸附法.79 氮气法测定孔隙度.80 诱导产纤维素酶

84 孢子液的制备.84 秸秆材料诱导里氏木霉或草酸青霉产纤维素酶.84 III 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 诱导酶液活性测定.85 酵母遗传操作

87 酿酒酵母感受态细胞的制备及转化.87 酿酒酵母基因组 DNA 提取.88 重金属操作

90 吸附实验.90 溶液中镉含量的测定.93 秸秆中镉含量测定.94 IV 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 分子克隆 DNA 提取 ? 水稻 DNA 提取 (1) 取水稻嫩叶

2 cm 左右放入 1.5 mL 离心管中, 用液氮研磨充分破碎细胞;

(2) 加入

650 μL 1.5 * CTAB,用牙签混合均匀;

(3) 65℃水浴

30 min,每5-10 min 摇动一次;

(4) 取出离心管,室温放置

10 min,加入

650 μL 等体积氯仿;

(5) 充分混匀,摇动

15 min.室温放置

2 min,12000 r/min,离心

10 min;

(6) 取400 μL 上清液转入到新离心管中(注意不要吸取下层杂质) ,加入等 体积,400 μL 异丙醇;

(7) 摇动

3 min,室温放置

2 min,12000 r/min 离心

8 min;

(8) 弃上清,加入 75%乙醇

800 μL,上下颠倒

3 次;

(9) 弃上清, 再加入 75%乙醇

800 μL, 上下颠倒

3 次,

7500 r/min 离心

2 min;

(10)弃上清,用10 μL 移液器充分吸除 75%乙醇,晾干;

(11)加入

50 μL ddH2O. ? 拟南芥 DNA 提取 (1) 取0.1 g 拟南芥幼叶,在600 μL CTAB 提取液中均匀研磨,转至 1.5 mL 离心管;

(2) 65℃水浴

30 min,每10 min 摇动

1 次;

(3) 冷却至室温后, 加入等体积的氯仿-异戊醇 (v: v/24: 1) , 轻柔摇匀

10 min;

(4) 室温,12000 r/min,离心

10 min;

(5) 转移上清,加入等体积异丙醇,室温放置

10 min;

(6) 室温,12000 r/min,离心

10 min;

(7) 弃上清,75%乙醇洗涤沉淀;

(8) 沉淀晾干,用50 μL TE 溶解,-20 ℃保存.

1 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 ? 棉花 DNA 提取 (1) 取0.5 g 棉花幼叶,在液氮中迅速研磨成粉;

(2) 加入

3 mL 65℃预热的 CTAB 提取液,快速振荡混匀,65℃水浴

30 min;

(3) 于离心管中加入 l mL

5 mol/L KAc,混匀,冰浴

20 min 后,用等体积的 氯仿:异戊醇(24:l)抽提 l 次;

(4) 4℃

12000 r/min 离心

5 min,取上清;

(5) 加入 2/3 倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,-20℃静置约

30 min;

(6) 用牙签挑出絮状沉淀,用75%的乙醇反复漂洗

3 次,再用无水乙醇漂洗 l 次,风干;

(7) 将沉淀重溶于

400 μL TE 中, 加入 l μL RNaseA (10 mg/L) , 37℃处理

1 h;

(8) 用酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)和氯仿:异戊醇(24:l)各抽提 l 次, 每次均 4℃

12000 r/min 离心

5 min;

(9) 取上清,加入等体积的异丙醇,-20℃放置约

30 min,12000 r/min 离心

5 min;

(10)弃上清,沉淀用 75%乙醇漂洗,干燥后溶于

200 μL TE 中,-20℃保存. RNA 提取 ? 水稻 RNA 提取 (1) 称取 0.1 g 样品(约为 1.5 mL 离心管

500 μL 刻度处) ,用液氮研磨成粉 末,加入

1 mL Trizol,涡旋振荡混匀,室温放置

3 min;

(2) 4℃,12000 r/min,离心

10 min,取上清液加入 0.2 mL 氯仿,剧烈振荡

15 sec,室温放置

3 min;

(3) 4℃,12000 r/min,离心

10 min,取上清液加入等体积异丙醇,上下颠倒 混匀,室温放置

10 min;

(或上清液加入

2 倍体积无水乙醇,上下颠倒混 匀,冰箱放置

30 min 以上) ;

(4) 4℃,12000 r/min,离心

10 min,弃去上清,用70%乙醇(乙醇:DEPC 水=7:3)洗涤沉淀两次;

(5) 室温干燥 RNA,加30-50 μL 的DEPC 水溶解 RNA,-80℃保存;

2 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 (6) 利用 DNase I 消化溶液中的 DNA;

在1.5 mL 离心管中配置下列反应液,共50 ?L: 试剂 体积(μL) 总RNA 20-50 ?g

10 * DNase I buffer 5.0 DNase I(RNase-free,

5 U/?L) 2.0 RNase Inhibitor(40 U/?L) 0.5 DEPC ddH2O Up to

50 37℃反应

30 min;

(7) 将反应液加 DEPC 水扩大到

400 μL,加入等体积氯仿,剧烈振荡

15 sec;

(8) 4℃,12000 r/min,离心

10 min,上清液加入等体积异丙醇,上下颠倒混 匀,室温放置

10 min;

(9) 4℃,12000 r/min,离心

10 min,弃去上清,用70%乙醇(乙醇:DEPC 水=7:3)洗涤沉淀两次;

(10)室温干燥 RNA,加30-50 μL 的DEPC 水溶解 RNA,-80℃保存. ? 拟南芥 RNA 提取 (1) 拟南芥样品约 0.1 g,加入

1 mL Trizol,在冰上充分研磨后装入 1.5 mL 离心管中,室温放置

3 min;

(2) 加入

200 μL 氯仿,剧烈振荡,放置

3 min;

(3)

4 ℃,12000 r/min,离心

10 min;

(4) 取上清,加入等体积异丙醇,轻柔混匀,室温放置

10 min;

(5)

4 ℃,12000 r/min,离心

15 min;

(6) 弃上清,用70% DEPC 乙醇洗涤沉淀

2 次;

(7) 室温干燥 RNA,加50 μL 溶解液,60℃水浴溶解

10 min 后,-80℃保存. ? 棉花 RNA 提取 【CTAB-PVP 法】 (1) 从-80℃冰箱中取出材料并放入研钵中, 加入液氮, 研磨样品, 每个

10 mL 离心管中加入 0.2~0.5 g 材料,并置于冰上;

3 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 (2) 加入4 mL 65℃预热的提取缓冲液和80 μL β-巯基乙醇, 充分震荡离心管, 65℃温浴

10 min,其间震荡离心管 2~3 次;

(3) 4℃

12000 g 离心

10 min.取上清液转移至新的

10 mL 离心管中,用等体 积的氯仿∶异戊醇 (24 ∶1 ) 抽提

2 次, 每次充分震荡, 冰上放置

10 min, 4℃

12000 g 离心

10 min;

(4) 转移上清,加入等体积的异丙醇轻轻混匀,-20℃ 0.5 h 沉降 RNA,4℃

12000 g 离心

10 min,弃去上清液;

(5) 加500 μL 70%冰冷乙醇洗涤沉淀

2 次,离心去上清,干燥沉淀;

(6) 加入

44 μL DEPC 处理的无菌水溶解;

(7) 加入

600 μL DEPC 处理的无菌水后,用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶24∶1 )和等体积的氯仿:异戊醇(24:1)各抽提

1 次,每次充 分震荡,放置

10 min,4℃

12000 g 离心

10 min;

(8) 取上清液,上清加入等体积的异丙醇,-20℃沉降

30 min;

(9) 4℃

12000 g 离心

10 min,弃掉上清,加1mL 70%冰冷乙醇洗涤沉淀两 次;

(10)干燥沉淀,加入适量无 RNase 的水溶解 RNA,样品置于-80℃保存备用. 【热硼酸法】 (1) 将提取缓冲液 (200 mmol/L 硼酸钠 (pH 9.0) ,

30 mmol/L EGTA,

10 mmol/L DTT, 1%SDS, 1%DOC (脱氧胆酸钠) 和2% PVP-40) 在80℃预热

10 min;

(2) 在液氮中将棉花纤维研磨成粉末,称取 1.0 g;

(3) 加入

5 mL 预热过的提取缓冲液,50 μL

100 mmol/L DTT,匀浆

2 min;

(4) 加入

200 μL 蛋白酶 K(20 mg/mL)混匀,42℃,摇床

100 r/min,温育 1.5 h;

(5) 加2mol/L KCl,至终浓度

160 mmol/L,冰上放置

1 h;

(6) 4℃,12000 r/min,离心

20 min 后,将上清液移入新离心管;

(7) 加入 1/3 体积的

8 mol/L LiCl,至终浓度

2 mol/L,4℃沉淀至少

5 h;

(8) 4℃,12000 r/min,离心

20 min,弃上清;

(9) 用4℃预冷的

2 mol/L LiCl 洗涤沉淀 2-3 次, 每次洗涤后 4℃,

12000 r/min, 离心

12 min;

4 华中农业大学生物质与生物能源研究中心实验操作手册 (10)用800 μL DEPC 处理的无菌水充分溶解沉淀;

(11)4℃,13000 g,离心

10 min,将上清转移到新的离心管;

(12)加2mol/L KAc 至终浓度

200 mmol/L,冰上放置

15 min 后,4℃,13000 g 离心

10 min,将上清转移于新的离心管;

(13)每管加 2.5 倍体积的无水乙醇,混匀后,放入-80℃沉淀

1 h;

(14)4℃,

12800 r/min, 离心

15 min. 用预冷的 70%乙醇洗涤

2 次, 每次

13000 g,离心

4 min.加入

40 μL 灭菌水 60℃溶解. 基因表达分析 ? 反转录合成第一链 cDNA 按照 Promega 的反转录酶体系进行操作.实验步骤如下:50 μL 体系 试剂 ........