PDF《实验一 特殊显微镜的使用方法》

细胞生物学实验 细胞生物学实验 实验一 实验一 特殊显微镜的使用方法 特殊显微镜的使用方法 细胞生物学实验 细胞生物学实验 实验目的 实验目的 了解暗视野显微镜、相差显微镜和荧光 了解暗视野显微镜、相差显微镜和荧光 显微镜的工作原理和使用方法.

显微镜的工作原理和使用方法. 细胞生物学实验 细胞生物学实验 实验原理和方法 实验原理和方法 ? ? 暗视野显微镜 暗视野显微镜( (Darkfield Microscopy) ? ? 相差显微镜 相差显微镜( (Phase Contrast Microscopy) ? ? 荧光显微镜 荧光显微镜(Fluorescence Microscopy) 细胞生物学实验 细胞生物学实验 暗视野显微镜 暗视野显微镜 ? ?工作原理 工作原理 ? ?装置-暗视野聚光器 装置-暗视野聚光器 ? ?暗视野光档大小的选择 暗视野光档大小的选择 ? ?适用于暗视野显微镜的样品 适用于暗视野显微镜的样品 ? ?使用方法 使用方法 细胞生物学实验 细胞生物学实验 暗视野聚光器,使光源 暗视野聚光器,使光源 的中央光束被阻挡.不 的中央光束被阻挡.不 能由下而上地通过标本 能由下而上地通过标本 进入物镜.从而使光改 进入物镜.从而使光改 变途径,倾斜地照射在 变途径,倾斜地照射在 观察的标本上,标本遇 观察的标本上,标本遇 光发生反射或散射,散 光发生反射或散射,散 射的光线投入物镜内, 射的光线投入物镜内, 因而整个视野是黑暗的 因而整个视野是黑暗的 . . 暗视野显微镜工作原理示意 暗视野显微镜工作原理示意 细胞生物学实验 细胞生物学实验 暗视野聚光器 暗视野聚光器 细胞生物学实验 细胞生物学实验 22~24 22~24 0.65 0.65

40 40X X 20~22 20~22 0.65 0.65

20 20X X 18~20 18~20 0.40 0.40

20 20X X 16~18 16~18 0.25 0.25

10 10X X 8~14 8~14 0.10 0.10

4 4X X 8~11 8~11 0.05 0.05

2 2X X 光档直径 (mm) 物镜开口值 物镜的放大倍率 物镜放大倍率与光档直径的关系 物镜放大倍率与光档直径的关系 细胞生物学实验 细胞生物学实验 暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品.这些 暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品.这些 样品因为具有和周围环境相似的折射率,不易在一般明视野之 样品因为具有和周围环境相似的折射率,不易在一般明视野之 下看的清楚,于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比 下看的清楚,于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比 .这种显微镜能见到小至 .这种显微镜能见到小至 4~200 4~200nm nm的微粒子,只能看到物体的 的微粒子,只能看到物体的 存在和运动,不能辨清物体的细微结构 存在和运动,不能辨清物体的细微结构 . . 尼龙纤维在明视野和暗视野显微镜下的对比 尼龙纤维在明视野和暗视野显微镜下的对比 细胞生物学实验 细胞生物学实验 使用方法 使用方法 (1) (1). .把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上. 把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上. (2) (2). .选用强的光源,但又要防止直射光线进入物镜,所 选用强的光源,但又要防止直射光线进入物镜,所 以一般用显微镜灯照明. 以一般用显微镜灯照明. (3) (3). .在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油,目的是不 在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油,目的是不 使照明光线于聚光镜上面进行全反射,达不到被检物体, 使照明光线于聚光镜上面进行全反射,达不到被检物体, 而得不到暗视野照明. 而得不到暗视野照明. (4) (4). .升降集光器,将集光镜的焦点对准被检物体,即以 升降集光器,将集光镜的焦点对准被检物体,即以 圆锥光束的顶点照射被检物.如果聚光器能水平移动并附 圆锥光束的顶点照射被检物.如果聚光器能水平移动并附 有中心调节装置,则应首先进行中心调节,使聚光器的光 有中心调节装置,则应首先进行中心调节,使聚光器的光 轴与显微镜的光轴严格位于一直线上. 轴与显微镜的光轴严格位于一直线上. (5) (5). .选用与聚光器相应的物镜,调节焦距,找到所需观 选用与聚光器相应的物镜,调节焦距,找到所需观 察的物像. 察的物像. 细胞生物学实验 细胞生物学实验 相差显微镜 相差显微镜 ? ? 工作原理 工作原理 ? ? 装置 装置 ? ? 适用于相差显微镜的样品 适用于相差显微镜的样品 ? ? 使用方法 使用方法 细胞生物学实验 细胞生物学实验 相位差的产生和对成像的影响 相位差的产生和对成像的影响 成像主要的三种光波: 背景波(Surround(S) Wave) 散射波(Diffracted(D) Wave ) 干涉波(Particle(P) Wave) 细胞生物学实验 细胞生物学实验 散射波 散射波 背景波 背景波 光程(Optical Path Length)等于折射率(n)与所经 物体的厚度(t)的乘积: Optical Path Length = n ?t 光程差(Optical Path Difference)等于: Optical Path Difference = ( n(s) C n(m) ) ? t 细胞生物学实验 细胞生物学实验 位相差(Phase Shift (Φ))等于 Φ= 2πΔ/λ 细胞生物学实验 细胞生物学实验 明视野下的相位差 明视野下的相位差 细胞生物学实验 细胞生物学实验 相差显微镜如何提高影像的对比程度 针对样品本体产生光强度对比的不足,相差显微镜将背景光 与散射光行进路径分开,并分别做不同的处理,以便加大两 者的相位差,足以发生完全相长干涉或完全相消干涉;