PDF《五、操作步骤》

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com 【百泰克生物】定货热线:010-62951781 Email:[email protected] -3- -4- 质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒,应加大菌体使用量,同时按 比例增加 P

1、P

2、P3 的用量,洗脱缓冲液应在 70℃预热.可以适当 的延长吸附和洗脱的时间,以增加提取效率. 4. 得到的质粒DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯 度.OD260 值为

1 相当于大约 50μg/ml DNA.电泳可能为单一条带, 也可能为

2 条或者多条 DNA 条带, 这主要是不同程度的超螺旋构象质 粒泳动位置不一造成, 与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度 等有关.本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 90%. 5. 要知道质粒 DNA 确切分子大小, 必须酶切线性化后, 对比 DNA 分子 量Marker 才可以知道,处于环状或者超螺旋状态的的质粒泳动位置不 确定, 是无法通过电泳知道确切大小的. 6. 洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA, 不影响下游酶切、连接等反应.也可 以使用水洗脱, 但应该确保 PH 大于 7.5, PH 过低影响洗脱效率.用 水洗脱质粒应该保存在-20℃.质粒 DNA 如果需要长期保存,可以用 TE 缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,PH 8.0) ,但是 EDTA 可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释.

五、操作步骤 * 第一次使用前请先在漂洗液 WB 瓶中加入指定量无水乙醇! (5 次的加入 75ml 无水 乙醇) * 将RNase A 全部加入溶液 P1 中,混匀,每次使用后置于 2-8℃保存. * 使用前检查各试剂是否有沉淀,若有请于 37℃溶解,再恢复至室温后使用. * 溶液 P2 用后请盖紧瓶盖. 1.柱平衡步骤:向吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中)加入

1 毫升的 平衡液,13,000 rpm 离心

1 分钟,倒掉收集管中的滤液,将吸附柱重 新放回收集管中. (请使用当天处理过的柱子) 2.取100-500 毫升过夜培养的菌液,8,000 rpm,离心 5-10 分钟,弃上 清,收集菌体,尽可能的倒干上清. 处理超过

50 毫升菌液可以离心弃上清后, 在同一个 50ml 管内加入更多的菌液, 重复步骤 1,直到收集到足够的菌体. 3. 用9ml 溶液 P1 重悬菌体沉淀, 移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮. 如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低. 4.加9ml 的溶液 P2,温和地上下翻转 6-10 次使菌体充分裂解,室温放 置4分钟,直至溶液变得清亮. 温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组 DNA 剪切断裂!所用时不应超过

5 分钟!以免质粒受到破坏. 此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘 稠后就可以做下一步,不是一定要准确的

5 分钟.如果未变得清亮,可能由于 菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量. 5. 加14.4ml 溶液 P3,立即轻柔地上下翻转 6-10 次,充分混匀此时会出 现白色絮状沉淀.室温静置

5 分钟,室温 10,000rpm 离心

15 分钟(加 大离心力可相应缩短离心时间). 注意:使絮状沉淀均匀分布,以便于离心. 6. 小心尽量吸取上清到新的离心管中,避免吸取到漂浮白色沉淀.加入 【百泰克生物】定货热线:010-62951781 Email:[email protected] 【百泰克生物】定货热线:010-62951781 Email:[email protected] -5- -2- 10ml 的无水乙醇,轻轻混匀,不要剧烈震荡. 7. 将步骤

6 所得混合溶液加入吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中) , 每次转移 10ml(沿柱内壁加入,以免冲破吸附膜,下同),10,000rpm 离心3分钟,弃滤液;