PDF《ABScript II One Step SYBR》

10 ?L

25 ?L ABScript II One Step Enzyme Mix 0.8 ?L

2 ?L 正向引物(10 μM) * 0.4 μL

1 ?L 反向引物(10 μM) * 0.4 μL

1 ?L ROX Reference Dye I (50X) 0.4 μL

1 ?L Total RNA **

2 μL

5 ?L RNase-free H2O to

20 μL To

50 μL * 通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果.反应性能较差时, 可以在 0.1-1.0 μM 范围内调整引物浓度.扩增产物的长度建议选择在 100~200 bp 范围内. ** 建议在

20 μL 的体系中加入

50 pg~300 ng 的Total RNA 为模板. 2. 推荐的 One Step RT-qPCR 反应程序: 步骤 温度 时间 循环数 (Cycles) 反转录 42℃

5 min

1 预变性 95℃

1 min

1 循环反应 95℃

5 s

40 60℃ 30~34 s 熔解曲线 仪器自动设置 延伸时间请根据您使用的 Real Time PCR 仪所需要的数据采集最短时间限 制自行调整:使用 StepOnePlus 时请设定为

30 s;

使用

7300 时请设定为

31 s;

使用

7500 时请设定为

34 s. 反应结束后确认 One Step RT-qPCR 的扩增曲线和熔解曲线, 进行标准曲线制作等. qPCR 反应有效性确认标准 1) 线性关系及扩增效率确认: 标准曲线相关系数(R2 )>0.98;

标准曲线斜率介于-3 至-3.5 之间 PCR 扩增效率(E)介于 0.9~1.2 之间 2) 重复性确认 重复管之间的 STD