PDF《第五部分二代测序.indd》

1 ?g) 良好的试验重复性 和一致性 良好的试验重复性 和一致性 PCR free ( ≥

50 ng) 实验例 图 1不同反应时间对 DNA 片段化效果的影响 使用 Fragmentation Mix 对10 ng 和1000 ng DNA 进行片段化处理.处理不同时长的反应 产物经 1.8X Ampure XP 微珠进行纯化后用于 Angilent2100 分析.

10 ng input DNA

1000 ng input DNA 灵活的上样量和片段处理长度 快速一站式建库方案(Illumina 平台适用) 适用文库 TIANGEN TIANGEN TIANGEN TIANGEN TIANGEN TIANGEN TIANGEN DNA 片段化 末端修复 A 尾添加 接头连接 PCR 富集 基因组文库 宏基因组文库 单细胞基因组文库 (所需总时间:2.5 小时) 5*WGS 片段化预混液模块 (Y9410F/L) WGS 连接酶模块 (L6030-W-F/L) WGS PCR 扩增模块(P7650L) WGS 酶切片段化与机械片段化效果比较 低上样量测序效果比较 机械切割 C 超声波 酶切 C 厂家 N 酶促反应 CWGS Fragmentation Mix Species %GC F.nucleatum

27 B.pertussis

67 E.coli

50 图2. 三种不同 GC 含量的细菌基因组 DNA 混合物经WGS Fragmentation Mix 处理后,基因组覆盖度的分析结果.每种基因 组使用量为

100 ng,三种基因组等摩尔混 合.结果表明:WGS Fragmentation Mix 对DNA 的片段化效果与超声破碎高度一致, 均不存在切割的偏好性. 图3. 三种不同 GC 含量的细菌基因组 DNA 混合物经 WGS Fragmentation Mix 处理后,基因组覆盖度的分析结果.每 种基因组使用量为

1 ng,三种基因组等 摩尔混合.结果表明:即使低至

1 ng 的DNA 上样量,WGS Fragmentation Mix 的片段化效果仍然与 超声破碎方法高度 一致,没有切割偏好性. Species %GC F.nucleatum

27 B.pertussis

67 E.coli

50 机械切割 C 超声破碎 转座酶 C Supplier I 内切酶 C Supplier N 酶促反应 CWGS Fragmentation Mix 二代测序文库构建

246 TIANGEN TIANGEN TIANGEN TIANGEN 图4. 不同初始量的基因组 DNA 使用 PCR 或PCR free 的方式进行文库构建,最终的 基因组覆盖对比对.结果表明:使用 WGS Fragmentation Mix 试剂及一管式操作和高效 的文库构建步骤,无论是否进行 PCR 富集, 所得到的 DNA 文库在片段覆盖度分布方面 均与机械破碎方法保持高度一致. 图5. 不同起始量样本(

1、

10、

25、

50、

100、

500、1000 ng)经PCR-free 方式进 行文库构建后,使用 qPCR 对得到的文库 DNA 进行定量分析结果.结果表明,在广 泛的上样量范围内,文库得率均呈良好的 线性关系.即使在上样量低至 1ng 的情况 下,文库构建效率也不会降低. PCR free 步骤测序与 PCR 富集后测序结果比较 Input DNA (ng) Library yield (nM)

0 0.5

1 1.5

2 0

20 40

60 80

100 Normalized coverage GC % over

100 bp regions 基因组覆盖度分析 Covaris (100 ng) with PCR Enzymatics WGS Fragmentation Mix (100 ng) with PCR Enzymatics WGS Fragmentation Mix (100 ng PCR-Free) Enzymatics WGS Fragmentation Mix (50 ng PCR-Free) Species %GC F.nucleatum

27 B.pertussis

67 E.coli

50 Normalized coverage GC % over

100 bp regions 图6. 经WGS 试剂片段化构建得到的DNA 文库,DNA 片段测序覆盖分布展示. 结........