PDF《Technical Manual》

概述 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST? 货号:CK12 规格: 100次、500次、2,000次 试剂盒内含 特点 操作示意图 所需的设备 和材料 测定前的 注意事项 储存条件 Technical Manual 图1 用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST? 测定细胞毒性的原理 - 双重选择:有2种检测方法 (一步法、低损伤法) - 操作简单:不需要分离死细胞和活细胞,就可检测死细胞的LDH *一步法 - 仪器常用:采用常规酶标仪检测 - 稳定方便:Working Solution可冷藏保存6个月,不需要现配现用 - 双重验证:配合使用CCK-8可获得死细胞和活细胞的结果 0-5 ℃ - CO2培养箱 - 20,

200 ?l多通道移液器 - 酶标仪 (带有490 nm滤光片) - 平底96孔板 *低损伤法 - 细胞培养用96孔板 *一步法:贴壁细胞和悬浮细胞都使用平底96孔板.

*低损伤法:贴壁细胞使用平底96孔板,悬浮细胞使用圆底或V底96孔板. - 本试剂盒使用玻璃容器及铝盖,建议使用时戴手套. - 因为每种细胞的LDH量不同,建议通过预实验确定高对照和低对照的吸光度差异最大的细胞数. - 培养基中动物血清中的LDH会增加背景吸收,建议设置一个培养基背景对照来校正. 动物血清中的LDH活性较高时,可以通过降低血清浓度来减小其中的LDH造成的背景吸收,一般 将血清浓度降低到5 %会显著减小背景而不影响细胞活力. 不推荐用1 % BSA来代替血清检测细胞介导的细胞毒性. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST? 是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶 (LDH) 活性进而测定细胞 损害的试剂盒.LDH是存在于细胞质的一种酶,当细胞膜受到损伤时,LDH会释放到培养基中.由于释放出的 LDH稳定,检测培养基中LDH量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标. 本试剂盒可以测定受损细胞所释放出的LDH,其原理是LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH,NADH通过电子 载体可将水溶性四唑盐WST? (无色) 还原成甲H产物 (橙色),WST? 甲H产物的吸光度与LDH量呈正比,利用此 原理可以测定死细胞和受损细胞的数量. 本试剂盒中试剂不会和活细胞反应,而且对细胞无损害,可以直接添加到含有细胞的培养基中检测 (一步 法).也可以分离细胞后,加到培养基中检测 (低损伤法,分离的细胞可以做其他实验).本试剂盒采用稳定性高 的WST? ,配置后的溶液可以长时间保存,不需要现配现用,适用于高通量筛选. Dye Mixture Assay Buffer Lysis Buffer Stop Solution 100次x111 ml x

1 1.1 ml x

1 5.5 ml x

1 500次x155 ml x

1 5.5 ml x

1 27.5 ml x

1 2,000次x455 ml x

4 5.5 ml x

4 27.5 ml x

4 加Working Solution (在高 对照孔中,在加Working Solution 前先加Lysis Buffer) 反应30 min 加Stop Solution终止反应 在490 nm测定吸光度 方法

1 操作步骤 一步法 *适用不需要收集活细胞进行其它实验的LDH 检测. *如果您需要收集活细胞进行其它实验,请选择方法2 :低损伤法. 配制Working Solution 1) 100次:加入1 ml Assay Buffer至Dye Mixture瓶子中,充分混合. 500次、2,000次:加入5 ml Assay Buffer至Dye Mixture瓶子中,充分混合. 2) 完全溶解后转移到Assay Buffer的瓶子中,充分混合. Working Solution请在0-5℃避光保存,稳定性可达6个月. 预实验 (细胞数的最佳化) *因为每种细胞的LDH量不同,为了得到最好的显色效果,推荐做预实验确定最佳细胞量. 1) 用培养基洗涤细胞后,制成5*105 cells/ml的细胞悬液. 2) 向96孔板中每孔加入100 ?l培养基. 3) 如图2所示,向96孔板中A行 (高对照和低对照各3个孔) 加入100 ?l细胞悬液后, 用多通道移液器按1/2比例用培养基稀释成一个系列细胞梯度. 另外,准备高对照Blank和背景Blank (只有培养基) 各3个孔. 4) 在37 ℃ CO2培养箱中培养. *培养时间设定与细胞毒性实验"3) 在37 ℃ CO2培养箱内培养合适的时间."一致. 5) 在高对照孔中加入10 ?l Lysis Buffer. 6) 在37 ℃ CO2培养箱中培养30 min. 7) 在每孔中加入100 ?l Working Solution,采用包裹铝箔等方法避光,在室温反应. *加入Working Solution后,吸光度与反应时间成正比,建议0-30 min内检测. *由于不同细胞差异较大,建议首次实验时,分别测定0 min,5 min,10 min,