PDF《技术方法》

文章编号 :100025404(2003)

0320263203 技术方法 海马脑片 LTP 中钙变化的激光共聚焦扫描技术测定方法 Method of Ca

2 + measurement with confocal laser scanning microscopy in LTP hipp2 ocampal slice 罗峻1,胡志安

1 ,黎海蒂

1 ,姚忠祥

2 ,徐海伟

1 (第三军医大学基础医学部 :

1 生理学教研室 ;

2 组织学与胚胎学教研室 ;

重庆400038) 提要:目的 探讨采用激光共聚焦扫描技术来测定海马脑片LTP 诱出过程中锥体细胞胞内游离钙的变化.

方法 海马脑片的常规孵育及 LTP 的诱出 ,通过间隙灌流法负载荧光剂 Fluo23AM 的海马脑片内游离钙的激光共聚焦测定.结果 直接用 Fluo23AM 孵育脑片 ,可得到轮廓清晰的神经元共聚焦图像 ,条件刺激诱出 LTP 之后 ,海马锥体细胞胞内游离钙显 著增高.结论 所述方法对实时测定 LTP 诱出过程中海马锥体细胞胞内游离钙的动态变化具有较好的效果.钙离子参 与了 LTP 过程中的信号传递. 突触传递长时程增强 (Long2term potentiation , LTP) 是学习记忆的重要细胞模式 [1] ,其中离体脑片 LTP 是 广泛采用的模型之一 ,钙离子在 LTP 和学习记忆的作 用历来受到特别的关注.大量文献报道钙离子在 LTP 中发挥了重要的作用.为了更好测定各种处理因素后 的脑片钙离子变化 ,人们一直在不断寻找理想的测定 钙离子技术.早期采用的是敏感钙离子电极等方法. 近年随着钙离子特异性荧光指示剂如 Fluo23 等的出 现 ,钙离子的测定开始进入定量和定位阶段 [2] .由于 脑片具有定位的特征 ,直接在脑片上观察钙离子的成 像的意义是不言而喻的.本实验拟介绍结合使用电生 理和激光共聚焦扫描技术(Confocal laser scanning micro2 scope , CLSM) ,观察海马脑片 LTP 中钙离子测定方法. 共聚焦显微镜在理论上使焦平面上的图像分辨率大大 提高(达到普通显微镜的

114 倍) [3] .由于脑片具有一 定厚度(一般为 300~500μ m) ,表面层次结构的观察普 通显微镜即可实现 ,但较深层次结构的观察则必须借 助激光共聚焦扫描显微镜以达到观察目的.脑片的钙 离子荧光标记方法国内已有报道 [4] .但在需要进行 LTP 电生理记录的条件下 ,选择何种标记方法尚未报 道.在对直接孵育方式进行改变之后 ,采用间歇灌流 标记法 ,我们观察了成年大鼠海马脑片 CA1 区锥体神 经元在 LTP 诱出后胞内钙离子的共聚焦成像. 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39600048) 作者简介 :罗峻(1973 - ) ,男 ,重庆市人 ,助理实验师 ,主要从事脑片诱发电 位方面的研究.电话 : (023)

68752254 通信作者 :胡志安 ,电话 : (023)

68752254 收稿日期 :2002210208 ;

修回日期 :2002212203

1 材料和方法

111 动物标本 Wistar 大鼠

22 只 ,鼠龄

2 个月左右 ,体重

150 g 左右.

112 仪器装置 仪器装置 :常规细胞外电生理记录装置一套 (其中记忆示 波器和微电极放大器购自日本光电) .半浸式脑片浴槽 (脑片 置于尼龙网之上) 为自制.激光共聚焦扫描显微镜系统购自德 国Leica 公司 ,所用激光波长是

488 nm ,光电倍增管收集波长大 于498 nm 的发射荧光.

113 实验方法

11311 大鼠断头处死后 ,取出一侧海马 ,顺海马槽纤维的走向 连续切片 ,片厚 400~500μ m ,迅速将其移至浴槽尼龙网上 ,随 之保 证持续的恒温人工脑脊液(Artificial cerebrospinal fluid , ACSF) 灌流 ,脑片的供氧以界面式进行 ,即让

95 %O2 与5%CO2 的混合气体通过外室热水加热、 湿化再弥散于脑片的表面 ,供 氧量为

1 dlΠ min.脑片在孵育

015 h 后 ,开始灌注含 Fluo23 (AM) 的ACSF.Fluo23 的浓度为 40μ molΠ L.灌流

1 h ,灌流量约 1~

115 ml ,采用间歇灌流方式.标记完毕后用 ACSF 冲洗

015 h ,随 后开始电生理记录.

11312 本实验刺激电极置于来自 CA3 区锥体细胞的 Schaffer 侧枝上 ,记录电极置于 CA1 区的放射层 ,所记录的电活动是 Schaffer 侧枝 CA1 区锥体细胞的场兴奋性突触后电位 (fEPSP) . 记录时 ,先行测试刺激 (Test stimulation , TS) ,测试刺激每 5~10 min 一次 ,以观察 fEPSP 是稳定 ,待其稳定

15 min 后 ,再行条件 刺激 (Conditioning stimulation , CS) .条件刺激

10 min 后 ,检测 LTP 是否产生.

11313 检测 LTP 后 ,取出脑片立即进行 CLSM 观察.观察时注 意调整聚焦平面 ,以获取最佳效果.由于脑片是在 ACSF 灌流 不足和无氧供应条件下进行 ,观测最好在较短时间内完成.

114 激光共聚焦 在急性分离细胞悬液中加入荧光探针 Fluo23Π AM(终浓度

5 3

6 2 第25 卷第

3 期2003 年2月第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol.

25 , No.

3 Feb.

2003 ? 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net μ molΠ L) 和3μ lΠ ml

25 %助染剂 Pluronic F2127 ,在37 ℃ 避光孵育

40 min.以记录液清洗

2 遍 ,再孵育

20 min.待Fluo23Π AM 在胞 浆中水解为 Fluo23 后 ,即可置激光共聚焦显微镜下观察. 以488 nm 波长的激光作激发光在

515 nm 处探测荧光发 射 ,选择形态佳、 贴壁好、 在3~5 min 保持荧光值稳定的细胞进 行监测 ,以测得荧光绝对强度代表 Ca

2 + 相对强度.每隔

20 s 扫描1次,直接监测单个神经元胞内游离钙浓度([Ca

2 + ]i) 在给药 前后的动态变化过程.在钙超载形成并稳定

1 min 后 ,加入用 人工脑脊液配置的 MT,使其在培养液中的终浓度分别达到

012 mgΠ kg(1 * MT) 至2mgΠ kg (10 * MT) ,荷包牡丹碱在 MT 前30 s 加入孵育液 ,以不含 MT的人工脑脊液作为对照组.

2 结果 采用自制的间歇灌流装置 ,得到了令人满意的实验结果 : LTP 诱出率比荧光剂在体微量注射标记法得到了极大的提高 ;

而和荧光剂直接孵育标记法相比 ,在节省荧光剂的同时 ,两者 的诱出率基本一致 ,见图 1. 图1间歇灌流法诱导海马 CA1 区的 LTP 未进行条件刺激的海马各区在 CLSM 下 ,可观察到较明显 的细胞带 ,但荧光强度低 ,神经元形态难于辨认.在诱出了 LTP 的脑片上 ,低倍镜下可见清晰、 排列整齐锥体细胞层 ,突起明 显 ;

高倍镜下可见直径、 长度大小不一的突起从胞体顶部和基 底部发出 ,见图 2.诱出LTP 后 ,海马脑片 CA1 区钙离子荧光强 度较诱出前明显升高 ,而海马其它各区荧光强度变化不明显. 图2诱出了 LTP 的海马各区在 CLSM 下的图像

3 讨论 众所周知 ,在LTP 和学习记忆机制中 ,钙离子是重 要的第二信使 ,阐明其中钙离子的定量和定位变化意 义深远.以往测定LTP 中钙离子变化的方法存在不够 直接和直观形象的缺点.由于亲脂性 Fluo23 (AM) 易 于透过细胞膜 ,激发光的波长恰好在可见光区范围内 , 适于激光共聚焦扫描显微镜 ,使得此种标记方法可能 成为观察 LTP 中钙离子变化的理想手段之一 [5] .但对 需要进行电生理观察的脑片负载 Fluo23 时 ,尚必须面 对以下几个问题 : ①如采用在体微量注射标记方法 (Fluo23 直接注入大鼠海马 ,进行在体荧光标记) ,则有 可能造成注射区域结构的破坏 ,不利于电生理实验. 同时 ,我们初步实验还........