PDF《照品的制备》

2011;

31(6) 南方医科大学学报 (J South Med Univ) ・ 技术方法 ・ 用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参 照品的制备 郭芳芳1 , 邹立林2 , 吴英松1 , 胡志明1 , 李金龙1 , 吕建新2 , 高基民2

1 南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所, 广东 广州 510515;

2 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室/ 浙江省模式生物技术与应用重点实验室, 浙江 温州

325035 摘要: 目的 通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白

10 (CFP10) 、 链亲和素 (SA) /CFP10 融合蛋白 (包括 SA-CFP

10、 CFP10-SA), 筛选灵敏度最高、 稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测 (TRFIA) 的参考标准品.

方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组为模板, 扩增CFP10基因, 将其克隆到pET24b、 pET24b-SA、 pET21a-SA三种载 体中, 转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达, 表达产物经镍离子亲和层析 (Ni-NTA) 柱纯化, 透析法复性.三种重组蛋白用 双抗体夹心法 TRFIA 从灵敏度、 稳定性两方面进行评价. 结果 成功构建了 pET24b-CFP

10、 pET24b-SA-CFP10 和pET21a-CFP10-SA三种表达载体, 重组蛋白CFP10主要为可溶形式表达, 融合蛋白CFP10-SA、 SA-CFP10均以包涵体形 式存在, Ni-NTA柱纯化后透析复性, 纯度均可达90%以上.三种重组蛋白经双抗体夹心TRFIA, CFP10-SA灵敏度最高 (0.02 μg/L) , 稳定性最好. 结论 得到了灵敏度高、 稳定性好的TRFIA检测CFP10的参照品CFP10-SA融合蛋白, 为研制 该结核分支杆菌时间分辨荧光诊断试剂盒, 并应用于临床打下了基础. 关键词: 结核分枝杆菌;

培养滤液蛋白10;

时间分辨荧光分析法 中图分类号: R318.13 文献标志码: A 文章编号: 1673-4254 (2011) 06-0955-05 Preparation and characterization of reference samples of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate protein-10 for time-resolved fluoroimmunoassay GUO Fang-fang1 , ZOU Li-lin2 , WU Ying-song1 , HU Zhi-ming1 , LI Jin-long1 , L? Jian-xin2 , GAO Ji-min2

1 School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;

2 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, China Abstract: Objective To prepare reference samples of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate protein-10 (CFP-10) and CFP10-streptavidin fusion proteins (CFP10/SA) for time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA). Methods The CFP10 gene was amplified by PCR from Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv and cloned into pET24b, pET24b-streptavidin (SA) or pET21a-SA expression vectors. The recombinant proteins CFP10, CFP10-SA and SA-CFP10 were expressed in Rosetta cells, purified via nickel affinity chromatography and refolded by dialysis. The sensitivity and stability of the resultant proteins as reference samples were evaluated by double-antibody sandwich TRFIA. Results CFP10-SA and SA-CFP10 fusion proteins were expressed as inclusion bodies, whereas CFP10 was expressed in a soluble form. The resultant purity of the

3 recombinant proteins all exceeded 95% . TRFIA results showed that CFP-SA fusion protein possessed the best sensitivity (0.02 μg/L) and stability. Conclusion The reference samples of CFP10 for TRFIA detection have been successfully prepared and can be used in the development of a diagnostic kit for Mycobacterium tuberculosis. Key words: mycobacterium tuberculosis;

culture filtrate protein 10;

time-resolved fluoroimmunoassay 结核病是由结核分枝杆菌引起的一种世界性人畜 共患传染病, 是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染 性疾病.当前全球约有1/3的人感染了结核杆菌, 每年 死于结核病的人数达300万, 我国结核杆菌感染率为 44.5%, 活动性肺结核患者451万, 每年死亡人数达13 万[1].因此, 控制结核病至关重要, 而控制其流行与蔓延 的关键就在于找到简便、 快速、 灵敏度高、 特异性强的诊 断方法.目前细菌学检查是结核病实验室诊断的金标 准, 但涂片阳性率低, 细菌培养费时间, 分子生物学检查 由于技术要求高, 通常仪器设备、 试剂费用较高, 难以在 临床得到广泛有效的推广及应用.免疫学检查的诊断 价值虽然不如细菌学检查, 但简便、 快速, 有一定的敏感 收稿日期: 2010-12-08 基金项目: 国家科技重大专项 ( 2008ZX10301 ) Supported by a National Special Fund for Major Sci-tech Development (2008ZX10301). 作者简介: 郭芳芳, 硕士研究生,