PDF《BioEasy SYBR Green I Real Time PCR》

3 充分混匀反应液,分装至各个 PCR 反应管中.在每个 PCR 反应管中,各加入 4ul 模板--- 质粒 DNA(10-10

7 拷贝) 、基因组 DNA(100pg-1ug)或cDNA(1pg-100ng).加入模板的体积 可作适当调整,但不应超过 10ul.

4 将加好模板的 PCR 反应管进行短暂离心,以确保所有试剂流到管子底部.

5 PCR 反应 Real Time PCR 反应程序设置如下: 三步法反应程序设置如下: 94℃,2min;

94℃,10s, 60℃,15s, 72℃,30s;

40cycles 荧光信号采集设在 72℃(每循环第三步反 应时);

二步法反应程序设置如下: 94℃,2min;

94℃,10s, 60℃,30s;

40cycles 荧光信号采集设在 60℃(每循环第二步反 应时);

5 融解度曲线程序设置如下: 95℃,2min;

72℃,1min;

95℃,30s,步进 0.5℃/s;

30℃,1min. 在运行之前,调节增益使荧光本底值≤20,也可根据试剂的实际情况调整;

仪器检 测通道选择设定为 F1 (SYBR Green I)通道. 注:在进行 PCR 程序选择时,无特殊要求建议采用三步法程序进行扩增.若两步法的扩增 结果与三步法的扩增结果一致,也可采用两步法替代三步法,以节约时间.

七、 结果分析与判定:

1 将标准品或参照物的浓度输入,选择样点拟合法进行分析,基线(零点调整)根据扩增 曲线实际情况选取一段相对平稳(无异常波动)的拐点之前的荧光信号作为基线调整,噪声 容限以基线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,然后进行定量 分析.也可根据仪器噪音情况另行调整.

2 分析后记录未知样品的浓度或 CT 值.

3 融解曲线分析有自动分析和手动分析,根据需要进行选择.分析后记录 Tm 值.

4 也可以选择利用琼脂糖凝胶电泳检查分析 PCR 产物的特异性.

八、 试剂盒使用注意事项

1 在实验前,请详细阅读此说明;

2 本试剂盒仅供科研使用,结果仅供参考.

3 融解后的试剂尽可能缩短常温放置时间,使用完毕后请立即保存于-20℃.

4 本试剂中含有荧光染料,保存试剂或配制 PCR 反应液时请避光放置.

5 核酸扩增时容易污染,导致结果不可靠.故要求在进行扩增实验时,严格按照标准 PCR 流程进行.