PDF《系统发育分析》

13 protein coding genes showed that

23 species of Acrossocheilus and Onychostoma were not clustered into monophyletic groups, and could not be clearly distinguished from each other. Key word: Acrossocheilus kreyenbergii;

Mitochondrial genome;

Phylogenetic analysis;

Acrossocheilus 与其他脊椎动物一样,鱼类线粒体 DNA (Mitochondrial DNA,mtDNA)呈单一的闭合 环状 DNA,由重链(H 链)和轻链(L 链)两 条链组成, 具自主复制、 转录和翻译等能力 (郭 新红等 2004) . 其长度一般在

16 ~

18 kb 之间, 包括

13 个蛋白编码基因、22 个tRNA 基因、2 个rRNA 基因和两段非编码区(D-loop 和轻链 复制起点 OL).与核基因相比,mtDNA 具有 母系遗传、进化速度快、分子小等特点,因而 使其成为鱼类进化遗传学、分子生态学、物种 鉴定和保护生物学等研究的重要分子标记(吕 国庆等 1998,肖武汉等 2000,赵凯 2006,陈 四海等 2011,Bernt et al. 2013a). 光唇鱼属(Acrossocheilus)隶属于鲤形目 (Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)亚科 (Barbinae),是一类栖息在山涧小溪或湍急水 流中的小型淡水鱼类,分布在中国、越南和老 挝(伍献文等 1977,方世勋等 1981,黄少涛 1984,林人端 1989,单乡红等 2000).分布 于中国的

20 种全部栖息在长江及其以南水系, 其中的许多种类已完成 mtDNA 全序列测定 (Ai et al. 2013,Han et al. 2013,Ma et al. 2014, Cheng et al. 2015,Xie et al. 2016).克氏光唇 鱼(A. kreyenbergii)最早由 Regan(1908)定 名为 Gymnastoma kreyenbergii, Yuan 等(2010) 通过外形特征的研究后发现,克氏光唇鱼与带 半刺光唇鱼(Barbus cinctus = Acrossocheilus hemispinus ) 为同物异名.原始产地 Nankancho,near Tinghsiang 之前一直被错 误地译为 河北定县附近的南谷庄 ,实际应 为江西萍乡市附近的南坑河,主要分布于西江 水系、鄱阳湖水系、浙江仙居和安徽石台(伍 献文等 1977,单乡红等 2000,Yuan et al. 2010).本研究旨在补充克氏光唇鱼 mtDNA 的全序列数据,并结合已有的相关数据尝试探 讨光唇鱼属和近缘属白甲鱼属(Onychostoma) 的系统发育关系.

1 材料与方法 1.1 线粒体全基因组的提取 克氏光唇鱼样本于

2015 年10 月采自江西 鹰潭市信江支流罗塘河, 用三层流刺网采集后, 用95%乙醇固定带回实验室,置于

4 ℃备用. 取背部肌肉

20 mg 放入培养皿中用蒸馏水浸 泡,中途更换一次蒸馏水.取出肌肉,吸干水 分, 放入 1.5 ml 离心管中, 再进行下一步操作. 采用动物组织基因组 DNA 小量提取试剂盒[生 工生物工程(上海)有限公司]提取基因组 DNA.选择双蒸水作为空白对照调零后,用Thermo nano drop 紫外分光光度计(NANODROP 2000C)测定样品在波长

260 nm 处的吸光度 A,即为样品 DNA 的浓度(g/L).

2 期 杨杨等:克氏光唇鱼线粒体基因组测定及光唇鱼属的系统发育分析 ・209・ 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 并保存于20 ℃ 冰箱中备用. 1.2 PCR 扩增 根据 NCBI 上已有的侧条光唇鱼(A. parallens)mtDNA 全长,在其保守序列区利用 Premier

6 .0 设计引物, 并用 Oligo 6.0 对每条引 物进行评价和修改,获得的

13 对引物(表1) 由生工生物工程(上海)有限公司合成. 表1本研究所用引物 Table

1 Primers used in this study 区间 Interval 引物名称 primer name 引物序列 Primer sequence(5′→3′) 16SrRNA Cyt b CYTB-1F CTAAAAGCATCGGTCTTGTAAT 16S-1R CTTTCTGTTTAGGTGGCTGC 16S-2R TGTAGGCTTATTTTGTTTATTTAT CYTB-2F CTCCTTTCATCTTACATCTCACAG 16S-3F TGGGGTCAGGTGGGTTATTA COX3 Cyt b COX3-2F CGCTGCCTGATACTGACACT CYTB-1R GTGTGTTTTTCGTAGGCTTG COX3-3F CTCTTATGACACCCGCACA CYTB-2R CTGTAATGTATTCGTTTGGCG COX3-4F GACTCAATGCGGGAACTTA CYTB-3R GGGGCTCCTATGATTACAAA COX3-5F TTTCCGCTAACAGCAGTCT 16SrRNA COXI 16S-........