PDF《Fast HiFidelity PCR Kit》

10 pg-10 ng 1-10 ng 三步法: 94℃

2 min 94℃

15 sec 60℃§

10 sec

35 cycles 68℃ 15-30 sec/kb 68℃

5 min §退火温度为60℃可以在大多数体系中获得良好的扩增结果. PCR反应特异性不高时,可以在60-68℃范围内适当增加退火 温度;

如果引物Tm值小于63℃,可以将退火温度按Tm值进行 设定. 2. 当扩增产物出现杂带或弥散时,请尝试两步法或 Step down PCR(降落PCR). 94℃

2 min 94℃

15 sec

35 cycles 68℃

30 sec/kb 68℃

5 min 3. 结果检测:反应结束后取5 ?l反应产物,琼脂糖凝 胶电泳检测. 出现问题 可能原因 解决办法 将延伸时间延长为1 min/ kb 增加2-5个循环 使用Step down PCR(针对

6 kb以上扩增片段效果明显 ) 减少cDNA模板用量(以减少 对PCR的抑制作用) 使用20*Fast PCR Enhancer 按终浓度2-5%添加 DMSO 重新配制或设计引物 对50 ?l反应体系,将酶量从标 准的2.5 U增加到到3.75-5 U 尝试两步法或Step down PCR 减少2-5个循环 重新配制或设计引物(引物较长 些往往可消除弥散、杂带现象) 按照说明书中推荐模板用量添加 对50 ?l反应体系,将酶量从 标准的2.5U减少到1.25-2 U 循环条件 不合适 模板过量 或纯度不佳 模板复杂 引物降解 或设计不 合理 酶量过少 循环条件 不合适 引物降解或 设计不合理 模板过量 酶量过多 无扩增 产物或 扩增产 物很少 杂带或 弥散 常见问题