PDF《第 8卷 第 4期》

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7 另外 , 使用 N C M 除了提高检测的灵 敏度 外,还具有 如下优 点:一是 和无 色的 N C M 相比,产生鲜明的色斑 . 形成强 烈的对 比;

二是 D o t ― E L I S A或者NCM-ELISA的操作要 比DAS―ELISA更容 易,每张 N C M 的包 被、洗涤 、 酶标记 I g G的反应都被作 为一个整体在~平皿 中或者一个 塑 料袋 (

1 2 c m长x8 c m宽)中进行 i 三是不需要同位紊和昂贵的 仪器设备 . 本 文以 NC M 作为 固相 载体 , 在Banttari和Goodwi n [ 方法的基 础上 略作 改进 , 对提纯病 毒、温室接 种感病 毒烟 草、感病 马铃薯芽 、 休 眠块茎 的顶端 中的 P VX、 P V Y和PVS进行测 定.材料 和 方法 l 试剂 A p 、 唧、BCIP(S~gmaChemicalCO),GAR-G(北京生物制品所) . N C M( 孔经为 O . d

5 岬,)PVP(MW{40000,Ⅱ本进 口) .

2 待测植物和病毒 用PVX、 p V Y和pVS(毒源来 自内蒙古大学生物系温室) 分别接种普通烟和地烟 , 接种植 物 在温 室叶|培养了3一d个星 期.用于提纯 病毒和 D o t ・ E L I S A 以及 C o c k ~ a i l - E L I S A 的测定样 品.感病马铃 薯块 茎取于大 田材料 .

3 病毒提纯爰多克隆抗血清 将E述经接种 p V X 、 p V Y和PVS培养的烟草用于病毒的提纯.提纯 p V X的主 要 步骤如 下:感病烟 p t - ~ n 入0.1mol/LpH7.2p(内古 o '

2 ‰藐 基乙 醇、0.Olmo l / I , E D I '

A N a

2 ) 匀浆 , 两 层纱 布 过滤之后 一 于汁液 中加入

1 /

4 体积的氯仿和正丁醇 (

1 ・

1 ) 混合暂乳化

2 O 分钟 , 低速离心收取上清 , 加入

6 P E G( Mw

6 0

0 0 ) 沉淀病 毒d一6小时 .

8 0

0 0 r / m 离心 收集 沉淀 . 用o'

01r,~/ L p H7 .

2 p B 悬浮.4000r/m离 心10分钟 - 上 清液做

2 O % 蘸糖垫 层超离心(35000r/m.

9 O分钟 ) . 沉 淀悬 浮后进行 蔗糖 密度梯度离 心 .梯 度为2O、3o、帅%和5 O ,

2 0

0 0

0 r / m离心

3 小时 . 收取梯度液巾的病毒带 , 对O.O1tool/Lpl-lZ.2p'

透析 .病毒 古量按照 A , =2 .

9 嗍来测定. 取纯化的 P V X病毒免疫家兔. 最初三次均为病毒液加不完全佐荆 - 病毒古 量均为

2 Ⅱ l g , 是后一次用

3 m g 的纯病毒免疫, 一星期后耳静脉采血制备抗血清 用微量沉淀实验测定抗血清的 效价 提纯 p r y和PVS所用的埕冲液分别为 m

2 咐l/LPBpH7.0和o.1rr~l/L柠檬酸缓冲液 、 p H

8 .

2 含0.叭,rol/LE饥'

^ N a z - m

2 ‰巯基乙醇- p r y和PVS病毒含量分别按照 E I 盏.=2 ・

8 1

1 0 ] 和劬一3 . 来测 定 其余病毒的提纯程序 、 制备抗血清及抗血清技价的测定同上.三种病毒抗血清效忻均为

1 :

4 0

9 6 .

4 l ( P v ) ( 、 p r y、 p V S ) 制备免疫 球蛋白( I ) 的制 备按照 C l a r k 和AdafrB的方法进 行[ 蜘. I g G 没有被 硅一 步用DE纤 维素 柱纯化 , 但 经过正常 植物 蛋 白的吸 收.

5 l g G( GA R) 爰其AP・lgG羊抗 兔lgG( GA R) 购于 北京生物恻品研 究所 , 其 酶结 台物(AP-IgG) 也足按照CLark和 A d a n l ~的方 法口 制备.6D ・ E L

1 S A的步骤

6 .

1 提取样 品 称取 l B 待 检样 品放入

8 *1

2 e m 的塑料 袋-IJ,加入 S ml 样 品提 取液 T B S ( ~ . I / l mo l / L T r i s . H C | , p H7 ・

5 ,

0 .

9 N a C I ,

0 . I )

5 ,

6 T w e e n -

8 0 ) l 含mOlmd / LE r Y r A Na ~ , 和o.01rr~l/LⅨB C A. 用大 试管彻底 研碎,静置

5 分钟 , 吸取 l m l 上清置于另一塑料袋巾 . 加入