PDF《技术手册》

技术手册 V3.

1 Eastep? Super 总RNA 提取试剂盒 (Eastep? Super Total RNA Extraction Kit) 产品目录号:LS1040 上海普洛麦格生物产品有限公司目录?产品描述.1 ? 试剂盒组份.1 ? 存储条件.2 ? 试剂配制.2 ? 预防 RNase 污染的注意事项.2 ? 不同细胞的破碎方法.3 ? 不同样品最适起始用量.3 ? RNA 分离纯化流程图

4 ? 从动物组织中提取 RNA

5 ? 从贴壁或悬浮细胞中提取 RNA

6 ? 从植物组织中提取 RNA

8 ? 从革兰氏阳性(枯草杆菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)细菌中提取 RNA.10 ? 不同材料提取 RNA 的得率

11 ? 问题及解决办法.12 ? 附录.13 1. PBS 缓冲液,(10*),pH 7.4.13 2. 胰蛋白酶-EDTA 溶液(1*13 3. 1*TE 缓冲液,pH 8.0

13 订购电话及技术支持请联系:普洛麦格(北京)生物技术有限公司 V3.1

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网址:www.promega.com.cn 第1页,共13 页 上海普洛麦格生物产品有限公司 ? 产品描述 Description RNA 的纯度和完整性在 RT-PCR、qRT-PCR、RNase 保护、Northern Blot、体外翻译 和微阵列分析等分子生物学实验中至关重要.近年来,RT-PCR 和qRT-PCR 已经演变成定 性、定量分析某些特定 mRNA 的有力工具.随着基因扩增技术的不断成熟,从组织、培养 细胞等小量样本中快速纯化得到无基因组 DNA 污染的高质量 RNA 的需求越来越迫切, Eastep? Super 总RNA 提取试剂盒也因此应运而生. Eastep? Super 总RNA 提取试剂盒(LS1040)为客户提供了一套从动物组织、植物组 织、培养细胞、细菌中小量纯化高质量、完整总 RNA 的解决方案.该试剂盒采用独特的细 胞裂解系统,无需使用苯酚、氯仿等有害物质,通过离心柱硅基质膜高效、专一地吸附核酸 分子,再经 DNA 酶处理去除基因组 DNA 的污染,最终得到高纯度的总 RNA. 本产品具有高效、快速、方便之特点,单个样品提取纯化一般可在

30 分钟内完成.使 用该试剂盒提纯的 RNA,不但纯度高, 而且基本无 DNA 和影响下游应用酶反应的杂质残留. ? 试剂盒组份 Cat.# Product Size LS1040 Eastep? Super Total RNA Extraction Kit

50 Preps Each system contains sufficient reagents for

50 isolations of total RNA from tissue, cells or blood. Includes: Cat.# Product Size SR220A RNA Lysis Buffer (RLA) 40ml SR221A RNA Dilution Buffer (RDA) 30ml SR222A RNA Wash Solution (RWA) 40ml SR223A 10XDNase I buffer 0.3ml SR224A β-mercaptoethanol 1ml SR120A DNase (lyophilized)

1 瓶SP119A Nuclease-Free Water 13ml SR320A Spin columns/ Collection Tubes (50/pack)

1 包SR321A Elution Tubes (50/pack)

1 包 订购电话及技术支持请联系:普洛麦格(北京)生物技术有限公司 V3.1

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网址:www.promega.com.cn 第2页,共13 页 上海普洛麦格生物产品有限公司 ? 存储条件 在收到试剂盒后,请将其中的 10XDNA 酶I缓冲液和 1-硫代甘油于 4℃保存.其它组 份于+15℃到+30℃保存.配制好的 DNA 酶I分装后于-20℃保存,加入 1-硫代甘油的 RNA 裂解液于+4℃保存

6 个月. 警告: 1-硫代甘油是低毒低浑发液体, 请戴手套并按照安全操作流程进行操作. 当处理人源、 感染的组织或者血液样品时,亦请参照安全操作流程作业并妥善处置有害物质. ? 试剂配制 在准备提取 RNA 操作之前,先准备好下列

3 种溶液. 溶液准备步聚注意事项DNA酶I 本试剂盒中提供DNA酶I干 粉共19.8KU. 按DNA酶I (冻 干粉) 瓶标所示, 加入550μl 无核酸酶水(试剂盒已提 供) , DNA酶I溶液终浓度为 1-2u/μl. 轻轻地旋转混匀溶液, 不要震荡. 我们建 议将溶解后的DNA酶I分装到无核酸酶的 EP管内(如,分成5-10等份)并于-20℃ 保存. 单次RNA的提取需要使用5μl DNA 酶I. !不要震荡DNA酶I溶液 !不要超过3次反复冻融DNA酶I溶液 RNA裂解液 将1-硫代甘油按2% (V/V) 加 入到RNA裂解液中. 加入1-硫代甘油后,即在瓶子上做好标 记.将RNA裂解液保存在4℃环境,保存 期6个月,每次使用后,请拧紧瓶盖. RNA洗液 向40ml浓缩的RNA洗液中加 入70ml无水乙醇. 加入乙醇后, 即在瓶子上做好标记. 试剂 可保存于15-30℃环境中,请拧紧瓶盖. 本产品呈淡黄色属正常现象. ? 预防 RNase 污染的注意事项 为防止在提取 RNA 过程中外源 RNA 酶的污染,必须采取以下措施:

1、 戴一次性干净手套和口罩操作,防止皮肤、唾液和实验室用品上存在的 RNase 污染.

2、 使用无菌无 RNase 的塑料制品和 Tip 头.

3、 若使用玻璃器皿须经过 0.1%DEPC 水在 37℃下浸泡

12 小时,然后经过 121℃高压灭 菌30 分钟,烘干后使用.

4、 配制相应的试剂必须使用经过 121℃高压灭菌的 0.1%DEPC 水. 订购电话及技术支持请联系:普洛麦格(北京)生物技术有限公司 V3.1

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网址:www.promega.com.cn 第3页,共13 页 上海普洛麦格生物产品有限公司 ? 不同细胞的破碎方法 为确保RNA抽提成功,选择合适的细胞破碎方法,保证样品在内源RNase作用前得到 充分裂解是至关重要的.具体为:细菌采用溶菌酶破壁;

植物组织要用液氮碾磨破碎;

动物 组织可用组织匀浆器或液氮碾磨破碎. 而选择液氮碾磨是破碎细胞的最佳方案. 不同材料的 裂解方法详见本手册各章节所描述的裂解物的制备. 使用液氮破碎细胞要特别注意: 在整个液氮碾磨过程中, 必须不断添加液氮, 避免样品 融化, 在碾磨结束样品融化前必须立刻加入裂解液, 用移液枪反复吹打直到裂解物中无明显 块状组织. 有些样品 (如胰脏) 含有大量核酸、 细胞碎片和蛋白质, 如果加入RNA裂解液后, 裂解混合物很粘稠不易吸取时,可以使用20G(或国产9号注射针头)的注射器来回吸放数 次,使裂解物便于吸取即可. 匀浆好的裂解物可以保存在-70℃备用.如果收集的样品如不立即进行RNA的提取工作, 就需要将离体后的组织迅速投入液氮冻住后再保存于-70℃冰箱或直接保存于液氮中直到使 用,防止反复冻融. ? 不同样品最适起始用量 样品的起始用量对 RNA 的提取效果有很大影响,任何裂解系统在接近样品最大起始量 时,抽提效果会明显下降.使用该试剂盒最佳样品起始用量为:细胞最佳用量 3*106 ,植物 组织 50mg,动物组织 20mg.对含基因组 DNA 特别丰富的组织(如:脾脏)应减少起始用 量.当抽提的 RNA 质量欠佳时,考虑解决的办法是降低样品的起始用量.如果想获得更多 提纯的 RNA,可以按比例放大样品处理量以及后续各试剂用量,分批上样过柱.在实验之 前,请参考表 1:不同样品起始用量与裂解液,稀释液的使用量进行裂解物的制备. 表1.不同样品起始用量与裂解液,稀释液的使用量 样品名称 样品起始用量 裂解液使用量 稀释液使用量 普通动物组织(肝脏、肾脏、心、肺、脑,等) 5-20mg 300?l 300?l 普通动物组织(肝脏、肾脏、心、肺、脑,等) 20-40mg 500?l 500?l 特殊动物组(脾脏等) 5-10mg 300?l 300?l 细胞 1.5*103 -5*106 300?l 300?l 植物组织(叶片,茎) 30-50mg 300?l 300?l 植物组织(叶片,茎) 50-100mg 500?l 500?l 细菌,OD600 达0.6-1.0 时1ml 150?l 250?l 订购电话及技术支持请联系:普洛麦格(北京)生物技术有限公司 V3.1

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网址:www.promega.com.cn 第4页,共13 页 上海普洛麦格生物产品有限公司 ? RNA 分离纯化流程图 ? 处理好的样品加入 RNA 裂解液,颠倒离心管 3-4 次,混匀. ↓ ? 加入稀释液,用移液枪混匀. ? 动物组织、植物组织混匀后直接以最大速度离心

5 分钟. ? 细胞混匀后以 300-500xg(1100-1500)rpm 离心

5 分钟. ? 细菌裂解物混匀后不要离心. ↓ ? 离心后的动植物、细胞上清液中加入 0.5 倍上清体积的无水乙醇,混匀. ? 细菌裂解物中直接加入 300μl 无水乙醇,混匀. ↓ ? 混合液转移至离心柱,12000-14000xg 离心

1 分钟,弃滤液. ? 加入 600?l RNA 洗液洗涤,12000-14000xg 离心

45 秒,弃滤液. ? 加入 50?l DNA 酶I孵育液孵育

15 分钟. ? 然后加入 600?l RNA 洗液,12000-14000xg 离心

45 秒,弃滤液. ? 加入 600?l 洗液,12000-14000xg 离心

45 秒,弃滤液. ? 将离心柱重新安置于收集管上,12000-14000xg离心2分钟. ↓ ? 将离心柱安放在洗脱管上,加入 50-200?l 无核酸酶水,12000-14000xg 离心

1 分钟,收集的 RNA 保存于-70℃. 订购电话及技术支持请联系:普洛麦格(北京)生物技术有限公司 V3.1

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网址:www.promega.com.cn 第5页,共13 页 上海普洛麦格生物产品有限公司 ? 从动物组织中提取 RNA 准备下列材料: ? 小型组织匀浆器或碾钵及液氮(如:Brinkmann, Tissuemizer? 或Omini Micro homogenizer) ? 无水乙醇 ? 小型离心机 操作方法

1、 裂解物的制备 按照以下两种方法进行裂解物的制备: ① 必须使用新鲜或超低温冻存的组织.迅速将组织放入无核酸酶的 1.5ml EP 管或匀 浆管中,按起始量加入 RNA 裂解液(裂解液加入量见表 1) ,置冰浴中,用组织匀 浆器破碎细胞. ② 必须使用新鲜或超低温冻存的组织.迅速将组织投入到已加入液氮的碾钵中进行碾 磨,碾磨过程中要不断补充液氮,以防止组织融化,直至组织完全碾磨成粉末状. 将碾磨成粉末状的样品迅速转稳到无核酸酶的 1.5ml EP 管中称量,待剩余液氮将 要挥发尽时加入裂解液,用移液枪反复吹打直到裂解物中无明显块状组织.

2、 向裂解物中加入 RNA 稀释液(稀释液加入量参考表 1) ,用移液枪混匀.室温放置 3-5 分钟. 提示:如果动物组织样品来源比较珍贵,可以选择裂解物加入稀释液后置 70℃加热

3 分钟,可以提高 RNA 的得率.

3、 室温以最大离心速度离心

5 分钟.

4、 小心吸取上清液到新的 1.5ml 无核酸酶的 EP 管中. 提示:离心后, 如果在上清液表面形成一层固体状物时, 只要在吸取上清前用枪头将固 体状物拨到离心管一边即可.

5、 加入 0.5 倍上清体积的无水乙醇,用移液枪吹打 3-4 次以混匀.

6、 根据样品数量,取出相应数目的离心柱/收集管(离心柱已安放在收集管上) .

7、 将混合液转移到离心柱内. (如果混合液体积大于 750?l,需分批加入.每次加入的体 积不要超过 750?l) .

8、 12000-14000xg 离心

1 分钟.弃滤液,将离心柱重新放回到收集管中.

9、 向离心柱中加入 600?l RNA 洗液 (已加入乙醇) , 12000-14000xg 离心

45 秒, 弃滤液.

10、DNA 酶I消化 DNA 酶I要新鲜配制.取一无核酸酶 EP 管,加入下列试剂.以下是提取一管 RNA 需 要的 DNA 酶I孵育液的用量. 试剂 体积 10XDNA酶I缓冲液 5μl DNA酶I 5μl 无核酸酶水 40μl 注意:轻轻吸放混匀,不要振荡. 订购电话及技术支持请联系:普洛麦格(北京)生物技术有限公司 V3.1

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11、向离心柱中央加入 50?l 新鲜配制的 DNA 酶I孵育液,室温静置

15 分钟.

12、向离心柱中加入 600?l RNA 洗液,12000-14000xg 离心

45 秒,弃滤液.

13、向离心柱中加入 600?l RNA 洗液,12000-14000xg 离心

45 秒,弃滤液.将离心柱重 新安置于收集管上,12000-14000xg 离心

2 分钟.

14、将离心柱转移至洗脱管上(试剂盒提供) ,在离心柱膜中央加入 50-200μl 无核酸酶水, 室温静置

2 分钟,12000-14000xg 离心

1 分钟,将RNA 保存在-70℃. 提示:如果........