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1 产品目录号: LS2062,LS2068 技术手册 Eastep? qPCR Master Mix Kit 产品目录:LS1000 上海普洛麦格生物产品有限公司2目录 1.

产品描述.3 2. 试剂盒特点

3 3. 产品组分及储存条件.3 4. 一般注意事项.4 4.A. 光谱特征

4 4.B. MgCl2 浓度

4 4.C 兼容仪器

4 5. Eastep? qPCR Master Mix 操作步骤

5 5.A 应用 ABI 7500/7500Fast/StepOnePlus? Real-Time PCR System 的操作方法 ......6 5.B 应用 Roche LightCycler

480 Real-Time PCR System 的操作方法

9 6. 附录.10 6.A 实验条件优化.10 6.B 引物设计及使用说明.11 6.C Real-Time PCR 数据分析.11 6.D 相对定量 vs 绝对定量.13 6.E 常见问题

15 3 1. 产品描述 Eastep? qPCR Master Mix(2X)是采用 SYBR? Green I 嵌合荧光法进行 Real-Time PCR 的专用试剂.本 产品为 2X 预混液,简单易用,主要成份包括 GoTaq?热启动酶、MgCl

2、dNTP、专利的反应缓冲液、低浓度 的CXR(carboxy-X-rhodamine)参比荧光染料(性质与 ROXTM 相同)和SYBR? Green I 嵌合染料.产品附 带的独立包装的 100X CXR 用于需要高浓度参比荧光染料的仪器. SYBR? Green I 是Real-Time PCR 反应最常用的一种高灵敏的 DNA 荧光染料.SYBR? Green I 可以嵌 入双链 DNA 的双螺旋小沟并发出荧光,因此可以通过检测反应体系中的 SYBR? Green I 的荧光信号强 度,检测出 PCR 产物的数量,还可测定扩增产物的 DNA 熔解温度(Tm) . 2. 试剂盒特点 1) Eastep? qPCR Master Mix 利用抗体介导的 GoTaq?热启动酶.室温时 GoTaq?的酶活性被抗体阻断.预变 性95° C、2min 即可激活 GoTaq?酶活性.专利的酶/缓冲液配方能兼容更多的循环数(45-50 个循环)和 更长预变性时间的热循环程序(95° C,10min) . 2) Eastep? qPCR Master Mix 能检测 GC 含量较高(60%以上)的DNA 模板和耐受 DNA 模板中一定浓度的 PCR 反应抑制剂. 3) Eastep? qPCR Master Mix 系统提供最小的批间差异,在宽广的线性范围内保证高效、特异的扩增. 4) Eastep? qPCR Master Mix 中预混有 SYBR? Green I 和低浓度的 CXR,在不需要高浓度参比染料的仪器上 进行 Real-Time PCR 反应时,只需向 Eastep? qPCR Master Mix 中加入模板、引物、Nuclease-free water 即可,反应液可室温配制,操作简单方便. 5) 本产品附带单独包装的 100X CXR.在需要高浓度参比染料的仪器上进行检测时,需另外加入一定体积的 该染料,用于消除信号本底以及校正孔与孔间的荧光信号误差,方便客户针对不同型号荧光定量 PCR 仪实 验时选择对应浓度使用. 3. 产品组分及储存条件 目录号 反应次数 名称 规格 LS2062

500 次(20μl 反应体系) Eastep? qPCR Master Mix (2X) 1.25ml X

4 CXR(100X) 100μl X

1 Nuclease-free water 13ml X

1 LS2068

2000 次(20μl 反应体系) Eastep? qPCR Master Mix (2X) 1.25ml X

16 CXR(100X) 400μl X

1 Nuclease-free water 13ml X

2 储存条件: -20° C 避光保存.如需频繁使用,可避光存放于 4° C 不超过

6 个月.避免反复冻融.

4 4. 一般注意事项 A.光谱特征 Eastep? qPCR Master Mix(2X)采用 CXR 作为参比染料,该染料具有与 ROXTM 相同的光谱特征,激发波长 580nm,发射波长 602nm.采用含 CXR 的Eastep? qPCR Master Mix 进行基因定量时使用与 ROXTM 完全相 同的仪器设置. B.MgCl2 浓度 Eastep? qPCR Master Mix 中的 MgCl2 浓度已进行优化在大多数情况下可达到最佳表现.如需对镁离子浓度 进行调整,请加入 PCR 级的高浓度镁离子储存液(目录号:A3511,A3513) . C. 兼容仪器 Eastep? qPCR Master Mix 可用于任何能够检测 SYBR? Green I 或FAMTM 染料的仪器.Eastep? qPCR Master Mix 中已含有低浓度的 CXR 参比染料.对于以下仪器,可直接使用,无需再加入参比染料: ? Applied Biosystems

7500 and

7500 FAST Real-Time PCR System ? Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System ? Bio-Rad DNA Engine Opticon? and Opticon?

2 Real-Time PCR Detection System ? Bio-Rad /MJ Research Chromo4TM Real-Time PCR Detector ? Bio-Rad iCycler? iQTM and iQTM

5 Real-Time PCR Detection System ? Bio-Rad MyiQTM Real-Time PCR Detection System ? Roche LightCycler?

480 Real-Time PCR System ? Stratagene Mx3000P? and Mx3005P? Real-Time PCR System ? Stratagene Mx4000? Multiplex Quantitative PCR System ? Eppendorf Mastercycler? ep realplex Real-Time PCR System ? Cepheid SmartCycler? system ? Corbett Rotor-GeneTM

3000 and

6000 Real-Time PCR Rotary System 对于 ABI 仪器中除

7500 和7500 FAST 之外的型号,由于仪器本身的原因,需要高浓度的参比荧光染料, 请加入 100X CXR 参比染料至终浓度 1X(即每 20μl 反应体系加入 0.2μl 的100X CXR) .包括以下型号: ? Applied Biosystems ABI PRISM?

7000 and

7700 Sequence Detection System ? Applied Biosystems

7300 and

7900 HT Fast Real-Time PCR System ? Applied Biosystems GeneAmp?

5700 Thermal Cycler ? Applied Biosystems StepOneTM and StepOnePlusTM Real-Time PCR System 对于 Bio-Rad 仪器,如需加入 Fluorescein 染料进行孔间校正,请按仪器说明加入 Fluorescein.

5 5. Eastep? qPCR Master Mix(2x)操作步骤 本产品基于 SYBR? Green I 染料法 Real-Time PCR 对基因进行定量分析.为保证实验的均一性,请预先 配制足够量的无模板反应混合液,用于标准管和样品管的扩增反应(大约每

20 个反应,在配制时需多配

1 个反 应) . 以下步骤以 20μl 反应体系为例进行 PCR 扩增,如需增大或减小反应体积,请按比例增加或缩减各组分的 用量.以下操作步骤中,DNA 模板的加入量占反应体积的 10%(例如,20μl 反应体系,加入 2μl DNA 模板, 18μl 反应混合液) ,如加入 DNA 模板量多于或少于 2μl,请按照总体积 20μl 调整 Nuclease-Free Water 的量. 由实验者提供的材料 ? qPCR 引物、DNA 模板、阳性对照模板、标准品 ? 无菌、无DNA、无核酸酶的带滤芯枪头和离心管用于反应混合液的配制 ? 移液器、Real-Time PCR 仪、离心机 ? 与Real-Time PCR 仪器配套的 PCR 反应管或 96/384 孔板及封板膜 ? MgCl2 储存液(可选) 1) Eastep? qPCR Master Mix 在室温融化后置于冰上,用前颠倒、吹打或轻微震荡混匀,用离心机轻 微离心收集后使用. 2) 配制不加模板的反应混合液,吹打或轻微震荡混匀.将反应混合液分至各反应管,每管 18μl. 注意: a)Eastep? qPCR Master Mix 及反应混合液在使用前一定要混匀,防止试剂成分不均影响反应结果. b)混匀过程避免剧烈震荡,避免形成泡沫. c)因试剂含有 SYBR? Green I 荧光染料,使用过程中避免强光照射或长时间曝光. 3) 将稀释好的标准品 DNA 模板、样品 DNA 或Nuclease-free water(用作阴性对照)各2μl 分别加入 对应的反应孔中,注意更换枪头防止交叉污染. 4) 反应板/管封口,轻微离心去除气泡并将所有的反应组分收集至板/管底. 5) 使用 Real-Time PCR 扩增仪,按照以下通用的 PCR 程序进行 PCR 扩增反应(针对不同品牌及型号 的Real-Time PCR 扩增仪,可参考后续说明;

如需进一步条件优化,可参考附录 6.A) . Stage1 预变性 1cycle 95° C 2min Stage2 热循环 40cycles 95° C 15s 60° C 40-60s Stage3 熔解曲线(Dissociation stage)

6 5.A 应用 ABI 7500/7500Fast/StepOnePlusTM Real-Time PCR System 的操作方法 请按照仪器使用说明书并参考以下方法进行实验操作. 1) 按下表配制 PCR 反应混合液(反应液配制可在室温进行) : 组分 体积(20μl 反应体系) 终浓度 Eastep? qPCR Master Mix (2X) 10μl 1X DNA 模板 2μl* 上游引物(10μM) 0.4μl 0.2μM* 下游引物(10μM) 0.4μl 0.2μM* CXR (100X) 0.2μl* 1X Nuclease-Free Water 7μl 总体积 20μl 注意: ? *20μl 反应体系,DNA 模板的添加量通常在 100ng 以下.因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝 数不同,DNA 模板的加入量有时需要调整;

? 如果待测目的基因含量较低,欲使用本产品进行

2 Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩........