PDF《Thermo Scientific》

产品信息 Thermo Scientific Luminaris Color HiGreen qPCR 预混液 #K0394

20 ? L 体系可进行

5000 次反应 批号 有效期 -20 ° C 避光储存.

www.thermoscientific.com/onebio 分析证书 经质检确保该产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶. 以人类基因组 DNA

10 倍梯度稀释液为模板,配制

20 ? L 平行反应体系进行 qPCR 产品 性能检测.检测结果显示该产品的线性分辨率超过

5 个数量级的动态范围. 质量授权人: Jurgita Zilinskiene 目录 页码 产品组分.2 储存条件.2 产品描述.2 检测设计指南.4 模板.4 引物.4 必要对照.5 重要提示.5 实验方案.6 反应体系配制.6 PCR 循环条件.6 可选步骤.7 疑难解答.8 参考文献.9 须知.10 产品组分 组分 #K0391 20? L*

250 次反应 #K0392 20? L*

500 次反应 #K0393 20? L*

1250 次反应 #K0394 20? L*

5000 次反应 Luminaris Color HiGreen qPCR 预混液(2*)

2 * 1.25mL

4 *1.25mL

10 *1.25mL

4 *12.5mL 40*黄色样品缓冲液

1 *1.25mL

1 *1.25mL

3 *1.25mL

1 *13mL 无核酸酶的水

2 *1.25mL

4 *1.25mL

10 *1.25mL

2 *30mL 储存条件 -20 ° C 避光长期储存或

4 ° C 避光储存不超过一个月. 产品描述 Thermo Scientific Luminaris Color HiGreen qPCR 预混液 (2*) 是一种针对实时定量 PCR (qPCR) 反应和两步法 RT-qPCR 反应进行优化的通用即用型溶液. 预混合液包括经过优化 的PCR 缓冲液以及预混在 PCR 缓冲液中的热启动 Taq DNA 聚合酶、 尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 、 双链 DNA (dsDNA) 结合染料和三磷酸脱氧核糖核苷酸 (dNTPs) . 热启动 Taq DNA 聚合酶配合优化的缓冲液使用能确保 PCR 反应的特异性和灵敏性.双链 DNA 结合染料 SYBR? Green I 使得在不使用序列特异性探针的情况下进行 DNA 检测和分析成为可能.脱 氧三磷酸尿苷(dUTP)和尿嘧啶 DNA 糖基化酶(UDG)都包含在预混液中,用于残余污 染控制.Luminaris? Color HiGreen qPCR 预混液中添加了一种蓝色惰性染料,另外单独提 供了一管含有黄色染料的黄色样品缓冲液. 在qPCR 反应中混合这两种组分使得溶液变成了 绿色.这为移液提供了视觉辅助工具,降低了配制反应体系过程中出现移液错误的风险,尤 其是使用白色反应容器时.该染料不会影响 qPCR 检测的特异性或灵敏性. 在qPCR 反应中使用 Luminaris Color HiGreen qPCR 预混液能确保基因组模板、质粒模 板、 病毒模板和 cDNA 模板定量的重复性、 灵敏性和特异性. 使用需要 ROX 染料的仪器时, 可以单独购买 ROX 溶液(#R1371) .同时,对于分别需要 high ROX 和low ROX 的仪器, 我们还分别推出了 Luminaris Color HiGreen High ROX qPCR 预混液(#K0361/2/3/4)和Luminaris Color HiGreen Low ROX qPCR 预混液(#K0371/2/3/4) . 热启动 Taq DNA 聚合酶是一种经过化学修饰的 Taq DNA 聚合酶.通过对氨基酸残基 添加热稳定的封闭基团, 使得该酶在室温下失活, 能避免引物非特异性退火或引物二聚体的 延伸,提供更高的 DNA 扩增特异性.该酶可在室温下配制反应体系. 尿嘧啶 DNA 糖基化酶(UDG)和脱氧三磷酸尿苷(dUTP)都包含在预混液中,以防 止PCR 反应之间的残余污染(1).UDG 预处理能够除去先前反应中残留下来的所有含 dU 的 扩增子污染. HiGreen qPCR 缓冲液针对使用 SYBR Green I 的qPCR 进行了专门优化.其中含有氯 化钾 KCl 和硫酸铵[(NH4)2SO4],可提供较高的引物退火特异性.该缓冲液组分允许在较宽 的氯化镁(MgCl2)浓度范围下进行 PCR 反应.因此,通常不需要对 PCR 反应中的氯化镁 (MgCl2)浓度进行优化. SYBR Green I 是一种荧光插入染料,它与双链 DNA 结合结合会发出荧光信号.在qPCR 反应中, DNA 会不断积累, 荧光信号会随着 DNA 浓度的上升而成正比例增加. SYBR Green I 的激发和发射最大值分别在

494 nm 和521 nm 处,能与任何 qPCR 仪兼容. 蓝色惰性染料有助于追踪预混液移液至反应孔中的情况.使用者可轻松监测出 PCR 平 板中哪个孔是空的,哪个孔已经含有蓝色预混液.蓝色染料的最大吸收值在

615 nm 处. 40*黄色样品缓冲液与 Luminaris Color HiGreen qPCR 预混液一起提供, 用来染色和跟 踪样品.当使用蓝色预混液时,加入样品之前,PCR 反应混合液是蓝色的.加入样品后, 反应混合液变成绿色,这使得样品更容易进行移液跟踪.该缓冲液提供的是 40*浓缩液, 在最终反应体系中该缓冲液终浓度为 1*.该黄色样品缓冲液可以选择使用.该黄色染料的 最大吸收值在

413 nm 处. ROX 参比染料.使用需要 ROX 染料的仪器时,可以单独购买 ROX 溶液(#R1371) . ROX 可以加入到 2*预混液中,也可加入到单个反应的混合液中.在使用能够检测 ROX 的qPCR 仪时,如Applied Biosystems 的仪器,ROX 作为荧光信号标准化的内参,能够校正因 移液不准确和荧光波动而造成的孔与孔之间差异.ROX 的存在不会干扰使用 iCycler iQ 等 其他系统进行的 qPCR 反应,因为它不会参与 PCR 反应,并且具有不同于 SYBR Green I 的 发射光谱(激发/发射最大值分别在

580 nm/621 nm 处) . (参考表

1 选择特殊仪器所推荐的 ROX 溶液用量) . 表1针对特殊仪器所推荐的 ROX 溶液用量 仪器 20μL的反应中 ROX 的用量 1.25 mL 2*预混 液中 ROX 的用量 ROX终浓 度Applied Biosystems: 7300, 7900HT, StepOne ? ,StepOnePlus ? ,ABI PRISM?7000 and

7700 0.24 μL

30 μL

600 nM Applied Biosystems: 7500, ViiA?

7 Stratagene: Mx3000P ? , Mx3005P ? , Mx4000? 0.16 μL

10 倍稀释 *

20 μL

10 倍稀释 *

40 nM Thermo Scientific: PikoReal Real-Time PCR System Bio-Rad: iCycler? iQ, iQ5 and MyiQ?, Opticon?, CFX 96, CFX

384 Roche:LightCycler? 480, LightCycler? 2.0 Corbett: Rotor-Gene? 3000,

6000 Eppendorf: MasterCycler? ep realplex Cepheid: Smart Cycler? 不需要 不需要 不需要 *向18 μL 无核酸酶的水中加入

2 μL

50 μM 的ROX 溶液,混合均匀后,取0.16 μL 加入 20μL 的qPCR 反应体系. 对于分别需要high ROX和low ROX的仪器, 我们还分别推出了Luminaris Color HiGreen High ROX qPCR 预混液 (#K0361/2/3/4) 和Luminaris Color HiGreen Low ROX qPCR 预混液 (#K0371/2/3/4) . 检测设计指南 模板 模板量取决于模板的类型和质量. DNA 含有 Luminaris Color HiGreen qPCR 预混液的

20 μL qPCR 反应体系中最多加入

200 ng 的基因组 DNA 或10 ng 质粒 DNA.注意

1 ? g 质粒 DNA 中的质粒拷贝数等于 9.1 *1011 除 以质粒碱基数(kb) . 如果使用黄色样品缓冲液(可选) ,先将缓冲液加入到样品中达到某一浓度,以确保最 终反应体系中黄色缓冲液为 1*浓度.例如,在20 μL 反应体系中加入

5 μL 的样品,为在 最终反应中获得 1*黄色缓冲液浓度,则需要加入黄色样品缓冲液以获得 4*缓冲液浓度. 将10 μL 40*黄色样品缓冲液加入样品中并用无核酸酶水定容到

100 μL, 可制备得到 4*黄 色样品缓冲储备液,参照表

1 中的建议. 表1.

20 μL qPCR 反应体系中使用不同样品量时,样品中的黄色样品缓冲液的浓度: 待加入到 qPCR 反应(20 μL)中的样 品体积

1 ? L

2 ? L 2.5? L

3 ? L

4 ? L

5 ? L

6 ? L

7 ? L

8 ? L 样品中需要的黄色 样品缓冲液的浓度 20* 10* 8* 6.7* 5* 4* 3.3* 2.9* 2.5* 根据样品中的最终 浓度计算出

100 μL 样品中加入的

40 *黄色样品缓冲液 的体积. 50? L 25? L 20? L 16.7? L 12.5? L 10? L 8.4? L 7.2? L 6.3? L cDNA 对于第一链 cDNA 合成,我们建议使用 Thermo Scientific Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR,#K1641. 利用 Luminaris Color HiGreen qPCR 预混液进行的 qPCR 反应中,加入 cDNA(来自反 转录)的体积不应超过最终反应体积的 10%.如果待检测的是高丰度基因,建议先制备一 系列的 cDNA 模板的梯度稀释液,然后以此为模板进行 qPCR,这样能得到最准确的结果. 加入稀释的 cDNA 不应超过 qPCR 体系的 10%. 如果使用黄色样品缓冲液(可选) ,加入

5 μL 的40*黄色样品缓冲液到 20μL cDNA 合 成反应体系中,然后在

20 μL qPCR 反应中使用 2.5 μL 以上混合液(该混合液含有

2 μL 的cDNA 和0.5 μL 的黄色样品缓冲液) . 引物 qPCR 的引物设计是实现有效扩增、避免引物二聚体形成的最重要的因素之一. 使用引物设计软件,如PrimerExpress? 或Primer3 (frodo.wi.mit.edu) 或遵循下列 PCR 引物设计的常规建议: ? GC 含量:30-60%. ? 长度:18-30 个核苷酸 . ? 最佳扩增子长度:70-150 bp. ? 最佳解链温度(Tm) :60℃.两个引物之间的 Tm 差值应不超过 2℃. ? 3'

端最后

5 个核苷酸中为 G 或C核苷酸避免超过

2 个,以降低引物非特异性结合 的可能性. ? 避免扩增子中含有二级结构. ? 避免引物自身互补、 引物间的互补和引物中的正向重复, 以防止发夹结构和引物二 聚的形成. ? 大多数情况下,每个 qPCR 反应的最佳引物浓度为每条引物 0.3 μM.对于单个引 物,其最佳浓度范围为 0.05-0.9 μM,并且依据使产生扩增子的 Cq 值最低和形成引 物二聚体(如果存在)的Cq 值最高的原则来选择引物浓度. 必要对照 ? 无模板对照(NTC)对于评估试剂污染或引物二聚体来说是非常重要的.NTC 反应包 含除模板 DNA 以外的所有组分. ? 逆转录-(RT-)对照在所有 RT-qPCR 实验中都很重要,可用来评估 RNA 样品中的 DNA 污染.此对照反应应该在第一链 cDNA 合成期间执行,包含除 RT 酶以外的所有逆转录 组分.之后,将对照 RT-反应的样品加入到 qPCR 反应中,样品体积不超过 qPCR 反应 体积的 10%. 重要提示 ? 反应体系配制可在室温下完成.PCR 实验方案中的起始变性步骤能重新活化热启动 Taq DNA 聚合酶. ? 我们建议反应体积为

20 μL.对于某些特定的仪器,按照该仪器的推荐,可使用其他反 应体积.最低反应体积取决于 qPCR 仪器和耗材(遵循供应商的建议) .如果模板量大 的话,则可增加反应体积. ? 预混液的制备,包含除模板 DNA 以外的所有反应组分,有助于避免移液错误,是qPCR 反应中很关键的一步. ? PCR 循环从 50℃ UDG 处理

2 分钟步骤开始,然后 95℃初始变性

10 min,从而活化热 启动 Taq DNA 聚合酶. ? 处理期间, 应尽可能避免 Luminaris Color HiGreen qPCR 预混液 (2*) 溶液暴露于光下, 以避免荧光信号强度减弱. ? 每次 qPCR 分析需重新调整阈值. ? 当使用 Bio-Rad iCycler iQ 或MyiQ 时,可按照仪器制造商的建议,通过外部孔间差异因 子矫正板在每次实验开始时收集孔间差异因子.不要把荧光素溶液加入到反应混合液 中.孔间差异因子可用来补偿系统误差或移液误差. 实验方案 反应体系配制 1. 解冻后,轻轻涡旋和短暂离心所有溶液. 2. 计算出 qPCR 体系需要的所有组分体积,参照表

2 的建议. 表2. 反应体系配制: 组分

10 μL 反应

20 μL 反应

50 μL 反应 最终浓度 2*预混液*

5 μL

10 μL

25 μL 1*

10 ? M 正向引物 0.3 μL 0.6 μL 1.5 μL 0.3 μM**

10 ? M 反向引物 0.3 μL 0.6 μL 1.5 μL 0.3 μM** 模板 DNA(包 括黄色样品缓 冲液,可选) X μL X μL X μL 最终反应不超 过10 ng/μL 无核酸酶水 加到反应终体积为10 μL 加到反应终体积为20 μL 加到反应终体 积为50 μL * 提供最终浓度为 2.5 mM 的MgCl2. ** 大多数情况中, 最终引物浓度为 0.3 μM 是最佳的,但有些个例中可以将浓度设定在 0.05 μM 到0.9 μM 的范围内. 3. 室温下, 将每个 qPCR 反应的 2*预混液、 引物和水加入到反应管中, 制备成反应预混液. 4. 完全混合预混液,分配至 PCR 管或板中. 5. 将模板 DNA(≤200 ng/反应)加入到含有预混液的单个 PCR 管或板中. 注意: 对于两步法 RT-qPCR, 来自 RT 反应的 cDNA 体积不应超过最终 qPCR 体积的 10%. 6. 轻轻混合反应液,不要产生气泡(不要涡旋) .如果必要,可进行瞬时离心.气泡可会干 扰荧光检测. 7. 按照下面的建议,设置 qPC........