PDF《实时荧光定量 PCR 手册》

实时荧光定量 PCR 手册 单管 Assay

96 或384 孔板

384 孔TaqMan? Array Card OpenArray? 芯片 上图显示的为实时荧光定量 PCR 常用的产品形式.

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4 5 实时荧光定量 PCR 基础知识 数字 PCR 实验设计 反应板制备 数据分析 疑难解析 1.1 简介

2 1.2 实时荧光定量 PCR 概述

3 1.3 实时荧光定量PCR 组分概述

4 1.4 实时荧光定量 PCR 分析

6 1.5 实时荧光定量 PCR 荧光检测系统

10 1.6 熔解曲线分析

14 1.7 参比荧光染料

15 1.8 污染预防

16 1.9 多重实时荧光定量 PCR

16 1.10 内部质控品和参考基因

18 1.11 实时荧光定量 PCR 仪校准

19 1 1.1 简介 聚合酶链式反应 (PCR) 是分子生物学领域功能最强大的技 术之一.采用 PCR 技术,利用序列特异性寡核苷酸、热 稳定性 DNA 聚合酶和热循环,可将 DNA 或cDNA 模板内 的特异性序列拷贝或 扩增 数千至数百万倍.在传统 (终点) PCR 中,扩增序列的检测和定量是在反应结束,即 最后一次 PCR 循环完成后进行的,且需要 PCR 后分析, 如凝胶电泳和图像分析. 在实时荧光定量PCR (qPCR) 中, 每次循环均检测PCR产物.通过监测指数扩增期的反应, 用户可以确定靶点的起始量,且精度极高. 在理论上,PCR 可呈指数型扩增 DNA,使每个扩增循环 中的靶分子数倍增.在PCR 问世之初,科学家推断,通 过与已知标准品进行比较,利用循环数和 PCR 终产物的 量可以计算出遗传物质的起始量.为达到可靠定量的要 求,实时荧光定量 PCR 技术得以问世.如今终点 PCR 主 要用于扩增特定的 DNA, 用于测序、克隆及其它分子生物 学技术. 在实时荧光定量 PCR 中,每次循环结束后通过荧光染料 检测 DNA 的量,荧光染料产生的荧光信号与生成的 PCR 产物分子 (扩增片段) 数直接成正比.利用反应指数期采集 的数据,生成有关扩增靶点起始量的定量信息.实时荧光 定量 PCR 使用的荧光报告基团包括双链 DNA (dsDNA) 结 合染料或在扩增过程中掺入 PCR 产物的、与PCR 引物或 探针结合的染料分子. 利用具有热循环功能及荧光染料筛查能力的仪器,检测反 应过程中荧光的变化.实时荧光定量 PCR 仪通过绘制荧 光与循环数曲线,生成扩增曲线,表示在整个 PCR 反应 过程中积聚的产物 (图1). 实时荧光定量 PCR 的优点包括: ? 能够实时监控 PCR 反应的进程 ? 能够精确测定每个循环的扩增片段数量,从 而对样本中的起始材料量进行准确定量 ? 具有更大的检测动态范围 ? 在单管中实现扩增和检测,无需 PCR 后处理 在过去的数年中,实时荧光定量 PCR 已成为 DNA 或RNA 检测和定量的主要工具.采用上述技术,您可以实现精确 的检测,其准确度低至2倍范围,起始材料的动态范围达

6 至8个数量级. 图1. 相对荧光与循环数. 通过绘制每个样本的荧光信号与循环数曲线, 生成扩增曲线;

因此, 扩增曲线表示在实时荧光定量 PCR 实验过程中积聚的产物. 用于创建本图曲线的样本是连续梯度稀释的 DNA 靶序列. 相对荧光 循环数 荧光阈值 起始靶点 基线荧光

2 1.2 实时荧光定量 PCR 概述 本部分将概括实时荧光定量 PCR 的步骤.实时荧光定量 PCR 是在标准 PCR 技术基础上演变而成,常用于定量样 本中的 DNA 或RNA.利用序列特异性引物,可测定特定 的DNA 或RNA 序列的拷贝数.通过检测 PCR 循环的每 个阶段中扩增产物的量,实现定量.如果样本中存在高丰 度的特定序列 (DNA 或RNA),则在早期循环中即可观察到 扩增;

如果序列较少,则在晚期循环中方可观察到扩增. 利用荧光探针或荧光 DNA 结合染料,采用实时荧光定量 PCR 仪检测荧光并完成 PCR 反应所需的热循环,实现扩 增产物的定量. 实时荧光定量 PCR 的步骤 实时荧光定量 PCR 反应的每个循环包括三个主要步骤. 一般运行

40 个循环. 1. 变性:利用高温孵育将双链 DNA 熔解 为单链,并 松开单链 DNA 的二级结构.一般采用 DNA 聚合酶可 耐受的最高温度 (通常为 95°C).如果模板 GC 含量较 高,则延长变性时间. 2. 退火:在退火过程中,互补序列有机会发生杂交,因此,应根据计算所得的引物熔解温度 (Tm ),使用适当 的温度 (通常较引物的 Tm 低5°C). 3. 延伸:在70-72°C 之间,DNA 聚合酶的活性最佳,引 物延伸速度达每秒

100 个碱基.当实时荧光定量 PCR 中的扩增片段较小时,通常将该步骤与退火步骤合 并,温度为 60°C. 两步法 qRT-PCR 两步法定量逆转录 PCR (qRT-PCR) 的第一步是采用逆转录 酶(RT) 将总 RNA 或poly(A) RNA 逆转录为 cDNA.采用 随机引物、oligo(dT) 或基因特异性引物 (GSP) 完成第一链 cDNA 合成反应.为在实时荧光定量 PCR 应用中平均表示 所有靶点并避免 oligo(dT) 引物的 3'

偏差,许多研究人员 采用了随机引物或 oligo(dT) 和随机引物的混合物. cDNA 合成采用的温度取决于所选的 RT 酶.逆转录完成 后,将约 10% 的cDNA 转移至单独的管中,完成实时荧光 定量 PCR 反应. 一步法 qRT-PCR 一步法 qRT-PCR 可在同一管内完成第一链 cDNA 合成反 应和实时荧光定量 PCR 反应,简化了反应设置,并降低 了污染的可能性.需要使用基因特异性引物 (GSP).这是 由于在一步法操作中使用 oligo(dT) 或随机引物将生成非特 异性产物,降低了目的产物的量.

3 1.3 实时荧光定量 PCR 组分概述 本部分将概括实时荧光定量 PCR 实验的主要反应组分和 参数.在本手册后面的部分,将更详细地介绍一些特殊的 组分,如报告基团染料、参比荧光染料和尿嘧啶 DNA 糖 基化酶 (UDG). DNA 聚合酶 PCR 的性能通常与热稳定性 DNA 聚合酶有关,因此酶的 选择是反应成功的关键.影响 PCR 特异性的一个主要因 素是 Taq DNA 聚合酶在低温下具有残留活性.在反应的设 置中,引物可与 DNA 非特异性地退火结合,使得聚合酶 合成非特异性产物.通过采用 热启动 酶,可最大程度地 减少因引物错配形成非特异性产物的问题.采用热启动酶 确保了在反应设置过程和初始 DNA 变性步骤中,DNA 聚 合酶无活性. 逆转录酶 逆转录酶 (RT) 同DNA 聚合酶一样,亦是 qRT-PCR 成功的 关键.选择一种不仅能够提供高全长 cDNA 产量且在高 温下具有良好活性的 RT 至关重要.高温性能对于具有二 级结构的 RNA 的变性同样极为重要.在一步法 qRT-PCR 中,可在较高温度下维持活性的 RT 使您能够使用具有高 熔解温度 (Tm ) 的GSP,提高了特异性,降低了背景. dNTP 最好从同一供应商那里购买 dNTP 和热稳定性 DNA 聚合 酶,因为在实验中使用不同供应商的试剂,常常会出现阈 值循环 (Ct ) 灵敏度下降的情况. 镁离子浓度 在实时荧........