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[19]中华人民共和国国家知识产权局 [12]发明专利说明书[11]授权公告号 CN 100352920C [45]授权公告日 2007年12月5日 专利号 ZL 94107243.

6 [22]申请日 94.6.27 [21]申请号 94107243.6 [30]优先权 [32]1993.09.30 [33]JP [31]265416/93 [73]专利权人 株式会社林原生物化学研究所 地址 日本冈山县 [72]发明人 丸田和彦 久保田伦夫 杉本利行 三宅 俊雄 [56]参考文献 WO9203565A1 1992.03.05 ATCC,有灶 &

采,第17版1989.01.01 ATCC.CATALOGUEOFBACTERIA&

BACTERIOPHAGES, 第17版1989.01.01 WO-9203565-A1 1992.05.03 审查员 宋智刚 [74]专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专利商标 事务所 代理人 程泳 [51]Int.CI. C12N 9/24 (2006.01) C12P 19/04 (2006.01) C12P 19/12 (2006.01) C12R 1/41 (2006.01) C12R 1/13 (2006.01) C12R 1/20 (2006.01) C12R 1/265 (2006.01) C12R 1/32 (2006.01) 权利要求书

3 页 说明书

62 页 附图

8 页[54]发明名称 非还原性糖类生成酶及其制备和应用 [57]摘要 公开了一种新的非还原性糖类生成酶及其制备 和应用.这种酶可从Rhizobium sp.M-11(FERMBP41 30)和Arthrobacter sp.Q36(FERMBP-4316)等微生 物的培养物中获取,当其作用于还原性淀粉部分水 解产物时可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类. 当葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶作用于这种非还原 性糖类时,易于产生海藻糖.这种非还原性糖类和 海藻糖可广泛应用于食品、化妆品和药品中. 94107243.6 权利要求书第1/3页21.一种酶,于不存在海藻糖的条件下,当其作用于还原性淀粉 部分水解产物时生成具有如下式所示的海藻糖结构的非还原性糖 类, Gn-T 其中,符号 G 表示葡萄糖残基;

n 为一个或多个整数;

T 表示α,α-海藻糖残基, 所述还原性淀粉部分水解产物具有3个或3个以上葡萄糖聚合 度;

所述的酶获自选自如下的微生物:根瘤菌属(Rhizobium)、 节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆 菌属(Flavobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Curtobacterium 属、分枝杆菌属(Mycobacterium)和Terrabaeter属;

它具有如 下物理化学特性: (1)分子量 在用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)时, 约为76,000-87,000道尔顿;

(2)等电点(pI) 在用两性电解质等电电泳时,约为3.6-4.6;

(3)最适温度 在pH7.

0、培养60分钟时,约为30-40℃;

(4)最适pH 在40℃培养60分钟时,约为6.4-7.2;

(5)热稳定性 在pH7.0培养60分钟时,在至多达约35-40℃的温度下是稳 94107243.6 权利要求书第2/3页3定的;

(6)pH稳定性 当在25℃培养16小时,在pH约5.5-11.0范围内是稳定的, 所述酶具有下列一种或多种部分氨基酸序列: 1)X1-Arg-Thr-Pro-X2-Ser-Thr-Tyr-Arg-Leu- 其中符号 X1 表示Val 或Met , X2 表示Ala 或Val ;

2)Gly-Val-Glu-Asp-Thr-Ala-Phe-Phe-Arg-Tyr- ;

3)Leu-Val-Glu-Leu-Thr-Met-Pro-Gly-Val-Pro ;

4)Glu-Gly-Arg-X3-Ser-X4-Tyr-Ala-X5-Ala- 其中符号 X3 表示Gly 或Glu ;

X4 表示Pro 或Arg ;

X5 表示Val或Glu. 2.一种制备权利要求1中酶的方法,包括在一种营养培养液中 培养选自根瘤菌属、节杆菌属、短杆菌属、黄杆菌属、微球菌属、 Curtobacterium属、分被杆菌属和Terrabacter属的微生物;

和从 所得培养物中回收这种酶. 3.一种能产生权利要求1所述酶的微生物,它选自根瘤菌属的 种? ? M-11? CCTCC? M94031和节杆菌属的种Q36? CCTCC M94030. 4.一种降低还原性淀粉部分水解产物的还原力的方法,包括用 权利要求1所述酶作用于含有一种还原性淀粉部分水解产物的溶液 的步骤. 5.如权利要求4所述的方法,其特征在于上述还原性淀粉部分 水解产物是一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的还原性 淀粉部分水解产物. 6.一种制备海藻糖的方法: 94107243.6 权利要求书第3/3页4(a)将权利要求1所述的酶作用于一种含有还原性淀粉部分水 解产物的溶液,以生成具有如下式所示海藻糖结构的非还原性糖 类;

Gn-T 其中,符号 G 表示葡萄糖残基;

n 为一个或多个整数;

T 表示α,α-海藻糖残基, (b)将葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于所得非还原性糖类, 以生成海藻糖;

(c)浓缩含有所得海藻糖的溶液;

(d)在所得浓缩物中结晶海藻糖;

和(e)回收所得海藻糖. 7.如权利要求6所述的方法,其特征在于所述海藻糖是有水或 无水结晶海藻糖. 8.如权利要求6所述的方法,其特征在于步骤b)还包括对在 步骤(b)中所得反应混合物采用强酸性阳离子交换树脂进行柱层 析,以提高海藻糖的含量的步骤. 9.如权利要求6所述的方法,其特征在于上述还原性淀粉部分 水解产物是一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的还原性 淀粉部分水解产物. 94107243.6 说明书第1/62页5非还原性糖类生成酶及其制备和应用 本发明涉及一种新的非还原性糖类生成酶,以及它的制备和应用. 更具体地说,涉及这样一种新的还原性糖类生成酶:当其作用于一种 或多种具有3 个或3 个以上的葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产 物时,生成一种具有海藻糖结构的非还原性糖类,还涉及这种酶的制 备,以及能够产生这种酶的微生物.本发明还涉及含有可由这种酶制 备的以海藻糖结构为末端单元的非还原性糖类的组合物,含有上述非 还原性糖类的还原性比较低的糖类,和/或由这种糖类所制备的海藻 糖. 海藻糖或α,α-海藻糖长期以来一直被认为是由葡萄糖单元组 成的非还原性糖类.正如在Advance? in? Carbohydrate? Chemistry, 18卷,第201-225(1963)中(由美国的Academic Press出版)和在Applied? and? Environmental? Microbiology,第56卷,3213-3215页(1990)中所公开的,海藻糖广 泛存在于微生物、蘑菇和昆虫中,但含量较低:由于非还原性糖类包 括不会与具有氨基的物质,如氨基酸和蛋白质反应的海藻糖,所以它 们即不会引起氨基-羰基反应,也不会改变含有氨基酸的物质:因此, 非还原性糖类被认为可以使用而不用担心会引起不理想的褐变和变质. 因为上述原因,就迫切需要建立一种制备这种还原糖的方法.在海藻糖的传统制备方法中,和在日本专利公开号No.154,485,75中所公开的,采用的微生物,或者如日本专利94107243.6 说明书第2/62页6公开号No.216,695/83中提出的,同时采用麦芽糖酶- 和麦芽糖磷酸化酶将麦芽糖转化成海藻糖.然而,前一种方法不适于 工业规模的制备,因为海藻糖在作为原材料的微生物中的含量以干固 体物计(d.s.b.)低于15w/w%( w/w% 的表达形 式在说明书中可简化为 % ,除非另有说明),且分离和提纯步骤 复杂.而后一种方案具有如下缺点: (i) 因为海藻糖是通过葡萄糖-1- 磷酸生成的,作为底物的麦芽 糖不能以较高的浓度使用;

(ii) 因为磷酸化酶促反应体系是可逆 反应,所以目的产物海藻糖的产量较低;

(iii) 要保持该反应体 系的稳定和顺利延续其菌促反应实际上是困难的. 关于海藻糖的制备,在 F o o d ? C h e m i c a l s ,N o .

8 8 , 67-72页(1992年8月)上题为 Current? Status? of Starch? Application? Development? and? Related? Problems 的章节 中的标题为 Oligosaccharides 的专栏中有报道: 尽管海藻糖具 有广泛的用途,但是通过直接糖转移反应或水解反应的酶促制备海藻 糖的方法在本领域被认为从科学上来讲是不可能的. 因此,以淀粉 为材料酶促制备海藻糖的方法被认为从科学上讲是极为困难的. 业已知道,由淀粉材料,如液化淀粉、环状糊精和麦芽寡糖制备 的淀粉的部分水解产物通常以还原性末端基团为末端单元.在说明书 中,这种淀粉的部分水解产物被称为 非还原性的淀粉部分水解产 物 .这种还原性淀粉部分水解产物的还原能力通常表达为以其干固 体物重计的 葡萄糖当量(DE) 值 .业已知道,还原性淀粉部分 水解产物中那些具有较高的DE 值的产物通常具有较低的分子量和粘 度,以及较高的适宜甜度和反应性,且易与含有氨基的物质如氨基酸 94107243.6 说明书第3/62页7和蛋白质反应,使其品质发生不理想的褐变、发臭和变质.还原性淀粉都分水解产物的这些不利特性根据其DE值有所变化, 且还原性淀粉部分水解产物与其DE 值之间的关系是极为重要的.甚 至在本领域中一直认为要打破这种关系是不可能的. 打破这种关系的唯一途径是一种在较高的氢压下通过氢化还原性 淀粉部分水解产物将其还原性末端基团转化成羟基而将这种水解产物 制成非还原性糖类.不过,这种方法需要高压灭菌锅并耗费大量的氢 和能源,而且还需要较高的水平的控制或安全设施以免发生灾难.还 原性部分淀粉水解产物与所得产物不同,因为前者由葡萄糖单元组成 而后者,即所得淀粉部分产物的糖醇则是由葡萄糖和山梨醇组成,当 将其用在人体上时可能导致出现消化紊乱或腹泻症状.因此,迫切需 要建立一种降低甚至消除还原性淀粉部分水解产物的还原能力而又不 改变以葡萄糖单元作为其组分糖的状况的方法. 本发明的目的是要提供一种新的非还原性糖类及其应用,并由还 原性淀粉部分水解产物来制备,以使打破传统上认为的还原性部分淀 粉部分水解产物和其DE 值之间的关系,并揭示这种非还原性糖类的 新用途. 为达上述目的,本发明人广泛筛选了能产生一种新的非还原性糖 类生成酶的微生物,当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时,可 生成具有海藻糖结构的非还原性糖类. 结果,从日本冈山市和Soja 市的土壤中分别分离出了根瘤菌属 (Rhizobium) 的新微生物,命名为 Rhizobium? Sp.M-11 ,和节 杆菌属(Arthrobacter) 的新微生物,命名为 Arthrobacter? Sp. Q36 ;

并发现上述微生物能产生非还原性糖生成酶,当这种酶作用 94107243.6 说明书第4/62页8于还原性淀粉部分水解产物时,能生成具有海藻糖结构的非还原性糖 类,而且当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时容易制备出所需 要的非还原性糖类. 我们还发现,通过先将这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物再 将所得非还原性糖类用葡萄糖淀粉酶或α-葡萄糖苷酶处理可很容易 地制备出海藻糖.这样,本发明人完成了这一发明.此外,我们还从 常规微生物中广泛筛选了能产生这种酶的微生物. 结果发现,短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微珠菌属( M i c r o c o c c u s ) 、 弯曲杆菌(Curtobacterium) 和土杆菌属(Terrabacter) 的微生物与根瘤菌 属和节杆菌属的微生物一样能产生这种非还原性糖类生成酶,并且我 们完成了这一发明.另外,我们建立了制备含有这种非还原性糖类及 含非还原性糖类的还原性较低的糖类和/或由这种糖类制成的海藻糖 的组合物如食品、化妆品和药品的制品方法,而且我们完成了这一发 明. 图1 表示温度对由根瘤菌属的Rhizobium? SP.M-11 菌获得的非 还原性糖类生成酶的活性的影响. 图2 表示pH 值对由根瘤菌属的Rhizobium? SP.M-11 菌获得的非 还原性糖类生成酶的活性的影响. 图3 表示由Rhizibium? SP.M-11 菌获得的非还原性糖类生成酶 的热稳定性. 图4 表示由Rhizibium? SP.M-11 菌获得的非还原性糖类生成酶 的pH稳定性. 图5 表示温度对由节杆菌属........