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BD 生命科学 上海 COE 培训中心 BD FACSCelesta 培训手册 Serena Wang 地址:上海市徐汇区建国西路

445 号3楼(中科院上海生科院院内)

电话:400-819-9900

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网址: www.bdbiosciences.com/cn 5/20/2018

2018 2 Contents FACSCelesta 培训所需设备/试剂

3 FACSCelesta 流式细胞仪主机概览.4 FACSCelesta 每日开机程序.9 FACSCelesta 每 日关 机程序11 FACSCelesta 每月维护程序12 CS&

T 仪器性能状态自动监控.13 创建应用设定.21 三色淋巴细胞亚群 Diva 软件检测

26 DNA 测定

36 FITC AnnexinV-PI 凋亡检测.40 不定期维护.42 常见问题解答.44 附录 1:清洗液的选择

47 附录

2 FACSCelesta 常用试剂耗材

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3 FACSCelesta 培训所需设备/试剂 1. 普通低速离心机(实验要求为 300g,相当于 1000~1500rpm,可调转速及时 间,能离心 12x75mm 的5ml 试管);

2. 固定或可调节的加样器及相应枪头若干:10ul, 200ul, 1ml;

3. 涡旋混匀器;

4. 烧杯,量筒或移液管,三个清洁的玻璃或塑料带盖试剂瓶(50-100ml),一个棕色 瓶(约500ml),漏斗,滤纸;

5.

300 目过滤尼龙网;

6. 可放置 12x75mm 的5ml 试管的试管架 2-3 个;

7. 鞘液:BD FACSFlow? Sheath Fluid;

8. PBS 溶液和 DI 水:0.22?m 滤膜过滤;

9. FACSClean 清洗液或 NaClO(分析纯原液,用时以滤过的蒸馏水稀释,有效氯浓 度为 0.5%-1%,注意现用现配.);

10. BD FACSDiva CS&

T 微球货号:655050(50 test)或者 655051(150 test). 11. 需要一管 2ml 抗凝的人血样本 (最好是 EDTA-K3 抗凝);

12. 多聚甲醛. 附1: PBS 配制方法:800ml 蒸馏水中溶解 NaCl 8.0g;

KCl 0.2g;

Na2HPO4 1.44g;

KH2PO4 0.24g;

调节 pH 到7.2~7.4(用HCl 或NaOH 调节,各地蒸馏水的酸碱度 不同),加蒸馏水定容至 1L,0.22μm 滤膜过滤后,室温保存. 附2: 多聚甲醛配制方法:贮存液用 PBS 配制 4%多聚甲醛溶液,待完全溶解后(溶解时需 要不断搅拌,加热的温度小于 50℃),调整 PH 值在 7.2~7.4,并用 0.22?m 的滤膜 过滤后置于 2-8?C 保存.使用时,用PBS 稀释为 2%浓度的应用液.应用液 2-8?C 存放,可使用一周.

4 FACSCelesta 流式细胞仪主机概览 BD FACSCelesta 是一台多激光台式流式细胞仪,可检测 10-12 个荧光参数. FACSCelesta 使用固定校准的激光器,在流动室处聚焦光信号,光学系统接收发射的 荧光信号并将其转化为电子信号.电子系统将其转化成模拟的数字信号. 1. BD FACSCelesta 流式细胞仪各部件如下图和表所示: 注意!仪器顶部散热通风槽不要放置任何物品.阻塞散热通风槽可能会导致仪 器过热. 谨防触电!仪器顶部不要放置液体.液体洒到敞开的散热通风槽可能会导致触 电或损伤仪器. 2. 控制面板 控制面板组成如下图所示,每个部件对应的名称如下表所示: 编号 部件

1 散热通风槽(顶部)

2 控制面板

3 电源键

4 电源插头

5 液流传感器端口

6 上样管支架

7 散热通风槽(左侧)

8 空气和液流端口

9 光学系统门(多边形检测器 接收盘)

1 3

2 4

6 9

7 7

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5 编号 部件

1 系统指示灯

2 液流控制按钮

3 样本流速控制按钮

4 样本 ADJ 按钮(样本流速调节按钮)

5 状态显示屏

6 MODE 按钮

2 1

5 3

4 6

6 3. 液流系统 1) 系统指示灯:控制面板上有两种系统指示灯,即系统状态(System Status)指示灯和激活(Activity)指示灯.该指示灯用来指示鞘液桶和废 液桶的液面高度. LED 灯颜色 状态报告 需要采取的措施 状态 绿色 好无好黄色 注意!鞘液桶和废液 桶需要注意. 检测鞘液桶和废液桶液 面高度 鞘液桶液面过低和/或 废液桶液面过满 红色 注意! 立刻处理 鞘液桶和废液桶 清空废液桶 填充鞘液桶 鞘液桶空和/或废液桶 满2) 激活指示灯:该指示灯用来指示流式细胞仪开关是否打开以及样本获取指 示.下表描述了该指示灯在不同情况下的显示状态. 指示灯状态 LED 灯颜色 状态 长亮 蓝色 仪器开关打开 闪烁 蓝色 样本正在进行检测 www.BDbiosciences.com

7 4. 液流控制:可以通过三种液流控制按钮(RUN、STANDBY 和PRIME)设置仪器 运行. 1) RUN:此时上样管加压,样本从进样针(Sample Injection Tube, SIT) 进入到流式室.进样针处有样本管且样本管支撑架(Tube Support Arm, TSA)位于样本管下的中位时 RUN 按钮显示绿色.样本支撑架位于样本管 之下的左侧或右侧的旁位时,仪器自动进入 STANDBY 状态,鞘液流停 止,RUN 指示灯变为橙色. 样本管破裂或 Bal 密封损坏,RUN 指示灯也会显示橙色.详见常见问题解 答. 2) STANDBY:此时鞘液流动停止,以节省鞘液. 操作者暂时离开机器时,可在进样针处放置一管 DI 水(不超过 1mL)并 按下 STANDBY 按钮. 3) PRIME:去除流动室气泡,此时液流先从流动室流入废液桶,持续一段时 间后,流动室再自动充满鞘液.PRIME 结束后,仪器进入 STANDBY 状态. 注意:执行 PRIME 时,进样针处不能放置样本管. 5. 样本流速控制:样本流速有三种选择按钮:LOW、MED 和HIGH.样本 ADJ 按钮 可以在上述三种流速基础上进一步调节样本流速. 当样本 ADJ 设置为

250 时(具体数值可在控制面板上的状态显示屏上查看),样 本的 LOW、MED 和HIGH 流速分别为

12、35 和60 ?L/min.每按动一次样本 ADJ 按钮,样本 ADJ 指示值增加或减少 10.通过调节样本 ADJ,可以将样本 LOW、MED 和HIGH 流速调节到如下范围. 流速 样本流速(?L/min) Low 6C24 Med 17.5C70 High 30C120 6. 状态显示屏:状态显示屏可切换两种不同的展示界面,具体描述如下:

8 序号 描述

1 废液液面高度.显示的范围是 E(空)到F(满) ,从 左到右表明液面水平依次递增 20%,液面水平达到 80%时,系统状态指示灯变黄, 液面水平为 100% 时,系统状态指示灯变红.

2 鞘液液面高度.显示的范围是 E(空)到F(满) , 从右到左表明液面水平依次降低 20%.液面水平到 20%时,系统状态指示灯变黄, 液面水平为 0%时, 系统状态指示灯变红.

3 Fine Adj.表示当前样本的 Adj 值.Fine Adj 可以 从0-500 依次以

10 的幅度变化.Adj 值正常设定为 250.该设定值会持续到关机.

4 HTS 模式.表明仪器进入 HTS 模式.长按 MODE 按钮3秒以上可进入该模式.进入该模式后状态显示屏 不再显示该仪器状态且系统状态指示灯显示绿色. 长按MODE 键3秒以上可回到正常模式. www.BDbiosciences.com

9 FACSCelesta 每日开机程序1. 检查鞘液桶,如需要,加满鞘液;

检查废液桶,如需要,倒空废液. 2. 打开稳压器电源,启动计算机,在出现的登陆对话框中,输入用户名和密码,用户 名:administrator,密码:BDIS#1,点击 OK . 3. 双击打开 Tera Term. 4. 打开位于仪器右侧的总电源. 5. 查看 Tera Term 窗口,待出现文字描述后进行步骤 6;

若2分钟后 Tera Term 窗 口无任何显示,关闭流式细胞仪电源,5min 后重新打开. 6. 运行软件 FACSDiva,双击桌面上的快捷方式. 7. 在BD FACSDiva 软件出现登陆对话框后,无需输入用户名和密码,直接点击 OK . 8. 仪器自动联机,在 Cytometer 窗口中确认软件已经和仪器相连接即 Cytometer Connected . 单击工具栏中的 View 下面的 cytometer,可以显示该窗口. 如果有必要,选择 Cytometer>

Connect.

10 9. 排除管路和鞘液过滤器中气泡.将排气管路放入烧杯中,将排气接头末端按钮压在 烧杯侧面上,直到过滤器中有稳定的液流流出. 10. 将1mL DI 水管放至进样针处,支撑臂置于正位. 仪器选择 STANDBY 待机模式. 11. 预热 10min 后待用. www.BDbiosciences.com

11 FACSCelesta 每 日关 机程序1. 在进样针出放置一管

3 mL,10%的FACSClean 清洗液或者 0.5%有效氯的消毒 液,样本管支撑架打在旁位清洗套管

1 分钟. 2. 样本管支撑架置于中位,让仪器在 HIGH 状态下高速运行

10 分钟. 3. 将样本换成 DI 水重复步骤 1. 4. 将样本换成 DI 水重复步骤 2. 5. 按下液流控制面板的 STANDBY 按钮. 6. 进样针处放置一管装有

1 mL DI 水的管子. 7. 退出 Diva 软件. 8. 关闭计算机. 9. 关闭流式细胞仪总电源.

12 FACSCelesta 每月维护程序1. 短接鞘液过滤器.取下过滤器,连接两端的液路. 2. 清空鞘液桶,并用 DI 水冲洗鞘液桶. 3. 向鞘液桶中装入 2L 浓度为 10%的FACSClean 清洗液. 4. 清空废液桶. 5. 进样针处放一管装有

3 mL 浓度为 10%的FACSClean 清洗液,样本管支撑架打到 中位. 6. 按下液流控制面板上的 RUN 和 HIGH 按钮.确保样本 ADJ 设置为 250. 运行

30 分钟. 7. 按下 STANDBY 按钮,拉动排气阀,卸掉鞘液桶压力. 8. 用DI 水重复 2-7. 9. 装回鞘液过滤器,用鞘液填充鞘液桶. 10. 进样针处放一管装有

3 mL DI 水的管子,样本管支撑架打到中位. 11. 按下液流控制面板上的 RUN 和 HIGH 按钮,运行

10 分钟. www.BDbiosciences.com

13 CS&

T 仪器性能状态自动监控 CS&

T 仪器性能状态自动监控可根据每日仪器状态自动调整实验的电压设置,PMT 灵敏度及 仪器在工作中可能产生其它的一些变化,提高仪器设置的精确性,降低不一致设置造成的检测 误差,保证不同时间实验数据的一致性.同时可以追踪仪器性能,帮助用户了解仪器性能,以 及在使用过程中的仪器变化. 【创建新的 configuration】 实验建立前,确认机器 configuration 符合你的实验 . 1. 选择 cytometer>

view configuration,进入 cytometer configuration 注意当 CS&

T 模块运行时,BD FACSDiva 处于挂起模式,不接受使用者的操 作.当CS&

T 模块关闭时,BD FACSDiva 再次激活. 2. 右键 copy 复制 basic configuration.

14 3. 在客户文件夹下右键,paste 创建新的 configuration,直接键入新的名字或右键重命 名. 4. 选中新创建的 configuration,右键 Edit configuration,选中所用荧光染料,拖拉到 对应的检测通道,创建符合实验的 configuration. 5. 要应用某个 configuration 设置,选中并按 set configuration.点ok 即设置完成. 6. File>

Exit 关闭 CS&

T 窗口. 7. 选择 Edit>

user preference 在general 下选择 Load data after recording. 为了保证检查结果的精确性,流式细胞仪的光学设置必须同流式细胞仪的设 置匹配. www.BDbiosciences.com

15 【Define Baseline 基线设置】 新装机或者仪器配置发生改变的用户,通过运行 CS&

T 质量控制微球,可以报告仪器性能基 线.它为我们提供了仪器线性、探测器效率、光学背景、CV、电子噪音等性能参数的评估, 自动调整激光延迟和面积因子,有助于我们了解机器性能. 1. 样本制备:向0.5ml 鞘液中加入

3 滴混合均匀的 CS&

T 荧光微球( Cat. No.655050 ) 2. 打开 FACSDiva 软件--选择 Cytometer>

CST 3. 导入 CS&

T 质量控制微球批号 选择 Tools―Beads Lot―Import―选择从 BD 网站上下载的解压缩后的文件(文件名 与微球 LOT ID 一致).

16 CS&

T 文件下载网站: http://www.bdbiosciences.com/cn/instruments/research/software/flow- cytometry-acquisition/bd-facsdiva- software/m/111112/resourcestools/beadlotfiles 在右边 Setup Control 窗口下做以下设置.(如没有安装 Loader,跳过①、②选项, 直接 进入③、④) ①勾选此项 ②如果不使用手动上样,可在 plate Type 中选择使用 Loader 或者 HTS ③点击 Select Configuration ,打开仪器配置窗口. www.BDbiosciences.com

17 ④确定 Setup Beads 的ID 号4. 选择与本仪器相同的 configuration,点击 Set Configuration――OK. 5. 上样,选择 Define Baseline,Run. 随后出现 Running Cytometer Baseline window 窗口及 PMTVs (PMT voltages)窗口. 6. 在出现相应数据结果后点击窗口右下角的 Continue Setup,出现靶值结果图. 7. 点击右下角 Continue Setup,完成基线设置. 如果需要查看基线报告,点击 View Report. 完成基线设置点击 Finish. 8. 数据记录完成后,取下 CS&

T 样品管,样品支撑架上放置 1ml DI 水管.

18 【Check Performance 仪器性能状态自动监控】 每日运行 Performance Tracking 可自动调整实验的电压设置,PMT 灵敏度及仪器在工作中 可能产生其它的一些变化,提高仪器设置的精确性,降低不一致设置造成的检测误差,保证不 同时间实验数据的一致性. 1. 样本制备:向1/3 ml 鞘液中加入

1 滴混合均匀的 CS&

T 荧光微球( Cat. No.655050 ). 2. 打开 FACSDiva 软件.选择 Cytometer>

CST. 3. 在右侧的窗口中核对 Setup Beads 中CS&

T 荧光微球 ID 是否与设置基线时使用微球 的ID 号相匹配. 4. 检查流式细胞仪的配置是否与实验需要的参数相匹配. www.BDbiosciences.com

19 确定当前的参数设置是否有可用的基线. 如果仪器基线已经设定,继续第

5 步. 如果仪器基线未设定,则需要先设置仪器基线. 5. 上样. 6. Setup Control 窗口中,在Characterize 选择 Check Performance,点击 Run. 7. 确定样本支撑架在中位,并以低速运行. 8. 当performance check 运行完成后,点击 View Report,确定 cytomet................